Marcílio C. P. de Souto DIMAp/UFRN Expressão Gênica Marcílio C. P. de Souto DIMAp/UFRN

Expressão Gênica Todas as células em um organismo têm o mesmo DNA genômico Identidades celulares distintas ocorrem por causa de diferenças na expressão gênica (=transcrição & tradução) A transcrição ou não de um gene é, em geral, determinada pela presença/ausência de outros produtos dos genes (especialmente proteínas)

Expressão Gênica ... então os genes interagem em redes complexas: Gene A ativa gene B, que desliga gene C que aumenta (upregulates) A, ... Assim, perturbações em um único gene podem levar a mudanças na expressão de vários genes

Para que estudar Expressão Gênica ? As células e tecidos tem suas funções normais quando os genes são expressos de forma regulada A expressão alterada de um gene altera a homeostase do organismo, podendo gerar uma doença

Genômica Funcional O próximo passo após o sequenciamento: Entendimento da conexão entre seqüências de DNA e características fenotípicas do organismo Passo complexo Proteínas e genes interagem em redes altamente conectadas Tradicionalmente a biologia molecular vem trabalhando baseada no paradigma Um gene, uma função No entanto,...

Microarrays ... microarray podem medir a expressão de vários genes ao mesmo tempo Microarrays são em geral lâminas de vidro com uma matriz de pontos (spots) impressa sobre elas Um spot contém milhões de moléculas de DNA idênticas ou oligonucleotídeos (sondas) As sondas se ligarão a seqüências específicas de DNA, tais como cDNA de um gene O microarray pode conter milhares de spots Por exemplo, um spot para cada gene do genoma humano

Experimentos com Microarrays traduzido Quase todo mRNA mRNA da célula ~ genes expressos Triture células e extraia o mRNA Faça a transcrição reversa RNA Utiliza-se cDNA, que é mais estável Rotule cDNA das células de referência de verde (Cy3) e das células alvo (teste) de vermelho (Cy5) P. Ex.: Cy3=Célula Normal Cy5=Célula Cancerosa Hibridize ambas as amostras, células referência e alvo, em um único microarray proteína cDNA

Fabricação do Array (1/4) Seleção das sondas (cDNA) a serem impressas no array Três dos milhares de cDNA conhecidos relevantes para a questão biológica investigada Obtidos de bibliotecas de cDNA Ou feitos a partir de amostras de mRNA

Fabricação do Array (2/4) Amplificação por PCR

Fabricação do Array (3/4) cDNAs são imobilizados em pontos específicos no substrato

Fabricação do Array (4/4) Spot contendo várias cópias de cDNA (sondas) de um gene específico

Preparação da Amostra Amostra de células a ser analisada Amostra de (RNA experimental) Amostra de células de referência ou controle (RNA controle) 5’ 5’ AAAAA AAAAA 5’ 5’ AAAAA AAAAA Obs: Também pode ser realizados experimentos sem a amostra de controle e também para se comparar duas amostras de interesse Extrai RNAm 5’ 5’ AAAAA AAAAA 5’ 5’ AAAAA AAAAA

Síntese e Rotulação de cDNA (1/3) Primer TTTTT Transcriptase reversa dNTP 5’ 5’ AAAAA AAAAA TTTTT 5’ TTTTT 5’ Fita de cDNA é sintetizada Cada amostra é marcada com um corante diferente

Síntese e Rotulação de cDNA (2/3) AAAAA 5’ AAAAA 5’ AAAAA 5’ TTTTT 5’ TTTTT 5’ mRNA é degradado

Síntese e Rotulação de cDNA (2/3) DNA polimerase TTTTT 5’ TTTTT 5’ TTTTT 5’ Segunda fita do cDNA é sintetizada

Síntese e Rotulação de cDNA (2/3) TTTTT 5’ TTTTT 5’ TTTTT 5’ TTTTT 5’ cDNA é desnaturado

Síntese e Rotulação de cDNA (3/3)

array para hibridização Amostra é colocada no array para hibridização Amostra sob investigação Microarray

Hibridização (2/3)

Hibridização (3/3) Lava o excesso de cDNA das amostras rotuladas

Scanning (1/3) Scanner

Scanning (2/3) Software do scanner sobrepõe imagens

Scanning (3/3) Software do scanner sobrepõe imagens

Experimentos com Microarrays - Resultados O spot para o gene 1 = Vermelho se há mais mRNA 1 nas células de teste Verde se há mais mRNA 1 nas células de referência Amarelo se são iguais Preto se o gene não foi expresso Dados em geral expressos na forma de uma matriz de níveis de expressão relativa intensidade vermelha intensidade verde indexada pelos genes e as amostras das células de teste

Esquema de um microarray

Dados de Microarray Característica Classe g1 g2 gN-1gN Câncer Normal Padrão 1 Padrão 2 Padrão 3 Padrão i Padrão m Característica Classe Câncer Normal Câncer

Como é feita a análise ? Quando é feita a comparação dessas fontes, pode-se chegar a conclusões sobre a expressão gênica num determinado estado fisiológico

Algumas Aplicações Descoberta de genes Determinar quais genes estão sendo expressos em um determinado tipo de célula em um dado momento e sob certas condições Comparar a expressão dos genes em dois tipos de células diferentes ou duas amostras de tecido diferentes (tecido saudável x tecido doente) Examinar mudanças na expressão dos genes em diferentes estágios no ciclo da célula ou durante desenvolvimento do embrião Análise da regulação gênica Identificação de doenças genéticas complexas Descoberta de medicamentos e estudos de toxicologia Detecção de mutação/polimorfismo

Outras Tecnologias As técnicas de AM a serem descritas também podem ser aplicadas a dados de expressão gerados com outras tecnologias MPSS (Massively Parallel Signature Sequence technology) Brenner et al., 2000 SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) Velculescu et al., 1995 Real-time RT-PCR (Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction) Freeman et al., 1999