6 de novembro de 2006 Vila Mariana, São Paulo, SP. I SEMINÁRIO ESTADUAL DE VIGILÂNCIA DAS DOENÇAS PRIÔNICAS NO ESTADO DE SÃO PAULO 6 de novembro de 2006 Vila Mariana, São Paulo, SP. Etiopatogenia das Doenças Priônicas e identificação genética do agente infeccioso Vilma Regina Martins, PhD Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer

Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis Animais “Scrapie” ovelhas e carneiros Encefalolia Espongiforme Bovina (BSE) marta (MTE), cervo (CWD), felinos (FSE), antílopes (EUE) e primatas (ZPSE) Humanos Kuru Doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) Doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS) Insonia Familiar Fatal

Encefalopatias Espongiformes transmissíveis (cérebros) CJD BSE Kuru Scrapie

Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis Quem é o agente infeccioso? Quais são suas características físico-químicas? Como ocorre sua propagação?

Caracterização do agente infeccioso Cérebro de animais infectados extrato Purificação do agente infeccioso Inoculação em um animal sadio menor inóculo tem maior atividade infecciosa Produção da mesma patologia vista no primeiro animal

Susceptibilidade do agente infeccioso à UV scrapie (%) atividade Dose de UV gene bactéria bacteriófago

Características químicas do agente infeccioso Resistentes a agentes modificadores de ácidos nucléicos (nucleases e UV) Sensíveis a agentes modificadores de proteínas (proteases, SDS, fenol) Agente infeccioso sem material genético (DNA ou RNA) composto apenas de proteína (PrPsc) Prions = proteinaceus infectious particle Stanley Prusiner, 1983

Identificação do agente infeccioso agente infeccioso purificado Imunização de coelhos Produção de anticorpos contra o agente infeccioso Reação positiva em cérebro infectado Reação positiva em cérebro NÃO infectado ??? Cérebro sadio tem uma proteína semelhante à infecciosa Prion celular

Como ocorre a geração de novo agente infeccioso na ausência de material genético? Proposta: A proteína infecciosa catalisa a formação de novas proteínas infeccionas a partir da homóloga normalmente produzida pela célula. Prova: Importância da proteína prion celular na doença.

Proteína prion celular Gene codificador PRNP Cromossomo 20 humano Cromossomo 2 camundongo Deleção de PRNP em camundongos Animais “knockout” para PrPc

Camundongo PRNP “knockout” 90 140 190 240 340 390 440 100 60 40 20 80 Incubation time (days) Animais sem doença (%) PrP +/+ CD-1 PrP 0/0 Tempo de incubação (dias) A presença da proteína celular é absolutamente necessária para o estabelecimento de infecção por prions! Büller et al., Cell 73, 1339-47, 1993

Mecanismo de conversão PrPc- Prion Hipótese de “protein only” só proteína PrP gene PrP mRNA PrPc Célula normal PrP gene PrPc PrPsc PrP mRNA Célula infectada Adaptado de Weissmann, 1994

Proteínas com diferenças conformacionais PrPc Prion Altamente insolúvel Deposição em placas Normal

“Proteinaceous infection particles” Prions “Proteinaceous infection particles” Resistentes a agentes modificadores de ácidos nucléicos (nucleases e UV) Sensíveis a agentes modificadores de proteínas (proteases, SDS, fenol) Contém uma forma anormal de uma proteína celular, PrPc Diferem de PrPc apenas estruturalmente Presença de PrPc é absolutamente necessária para a infecção

Doenças humanas por prions Infecciosas/Iatrogenicas Transplante de córnea (CJD) Inoculação acidental de tecido cerebral(CJD) Hormônio de Crescimento (cadáver) canibalismo (Kuru) vCJD injestão de carne contaminada com BSE Genéticas Mutações no gene de Prion celular GSS, FFI, CJD Esporádicas caso completamente desconhecido 1:2,000,000

BSE X vCJD 2000 – 79 cases of vCJD (Hilton DA, J. Neuroph. Appl. Neurobiol 26 (5), 405-407)

Evidências da transmissão do BSE para humanos Transmissão de BSE para macacos induziu a formação de placas “floridas” similares às presentes na nvCJD. Prion Biology and Diseases, Stanley Prusiner, 2ª edição, 2003

Do intestino ao cérebro Translocação através do epitélio intestinal Mabbott & MacPherson, Nat. Ver. Microb. 4:201-211, 2006

Neuroinvasão a partir do intestino Vagus nerve Splanchnic nerve Mabbott & MacPherson, Nat. Ver. Microb. 4:201-211, 2006

Chronic Wasting Disease Barreira entre espécies Barreira entre espécies Scrapie ovelha Gado bovino EEB - BSE Humanos nvCJD Transplantes Transfusão sangüínea Barreira entre espécies ? Humanos Cervos Chronic Wasting Disease CWD

Possible transmission of variant Creutzfeldt-Jakob disease by THE LANCET • Vol 363 • February 7, 2004 Possible transmission of variant Creutzfeldt-Jakob disease by blood transfusion C A Llewelyn, P E Hewitt, R S G Knight, K Amar, S Cousens, J Mackenzie, R G Will Findings 48 individuals were identified as having received a labile blood component from a total of 15 donors who later became vCJD cases and appeared on the surveillance unit’s register. One of these recipients was identified as developing symptoms of vCJD 6·5 years after receiving a transfusion of red cells donated by an individual 3·5 years before the donor developed symptoms of vCJD. Interpretation Our findings raise the possibility that this infection was transfusion transmitted. Infection in the recipient could have been due to past dietary exposure to the BSE agent. However, the age of the patient was well beyond that of most vCJD cases, and the chance of observing a case of vCJD in a recipient in the absence of transfusion transmitted infection is about 1 in 15 000 to 1 in 30 000.

Doenças humanas por prions Forma Fenótipo Adquirida Kuru Doença de Creutzfeldt-Jakob iatrogênica (iDCJ ou iCJD) Doença de Creutzfeldt-Jakob nova variante(vdcj ou vCJD) Familial (hereditária) fDCJ ou fCJD) Insônia Familiar Fatal (IFF ou FFI) Doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS) Mista ou indeterminada Esporádica sDCJ ou sCJD Típica (MM1 MV1) Aparecimento precoce(VV1) Longa duração (MM2) Placas de Kuru (MV2) Atáxica (VV2) Insônia Fatal (sIF)

O gene PRNP e a proteína prion celular ORF EXON I INTRON EXON II Prnp ORF mRNA 5’ An  

Mutações na proteína PrPc associadas a doenças herdadas de padrão autossômico dominante 105 145 178 183 200 217 octa 102 117 171 180 198 210 232 4 ou 5 P P A y N D V T F E V Q M NH2 COOH < 3 ou > 8 L L V STOP S N I A S K I R R CJD Doença Psiquiátrica GSS CJD ou FFI Martins e cols, in Neuropsiquiatria Geriátrica, 2000

Curvas de mortalidade distribuídas por sexo e idade FFI Curvas de mortalidade distribuídas por sexo e idade FFI Sporadic CJ GSS New variant CJD

Anormalidades Psiquiátricas nvCJD X CJD esporádico nvCJD esporádico idade (anos) 29 60 Duratção (meses) 14 5 Sintomas iniciais Anormalidades Psiquiátricas Demência Sintomas sensitivos Sintomas cerebelares (% dos pacientes) 100 40

Presença de polimorfismos no gene PRNP   Codon 129 polimorfismo M129M 37% M129V 52% V129V 11%

Polimorfismo no codon 129 e susceptibilidade às doenças por prions Doença # indivíduos MET/ MET % VAL % VAL/ sadios 261 37 52 11 CJD esporádico 73 78 12 10 Iatrogênico 63 60 20 vCJD 24 98 2 -

Procedimentos de diagnóstico para doenças por prions Dosagem da proteína 13.3.3 Em LCR Avaliação de polimorfismos/mutações no gene PRNP Cérebro, orgãos linfóides e músculo esquelético

Cromatografia líquida Identificação de polimorfismos e/ou mutações no gene de prion celular (PRNP ) Sangue periférico Separação dos leucócitos Purificação do DNA DHPLC Cromatografia líquida de alta resolução Seqüênciamento direto

Identificação de polimorfismos e/ou mutações no gene de prion celular (PRNP ) Coleta de 5 ml de sangue periférico com anti coagulante (K3 EDTA) 4ºC – máximo 12 h -20ºC – maior tempo de armazenamento Gelo reciclável Gelo seco Envio ao Centro de Referência