Identificação do(s) componente(s) da matriz extracelular que está(ão) envolvidos com o mecanismo de estímula da síntese de PGHS causado pela heparina Bolsista: Patrícia Sampaio Monteiro - Iniciação Científica – PIBIC/CNPq Orientador: Prof. Dr. Edvaldo Da Silva Trindade Colaboradores: Tabata DMariella Freitas Klimeck, Gustavo Rodrigues Rossi, Célia Regina C. Franco Método Conclusões Referências Introdução Heparina é utilizada em clínica médica desde a década de 50 e, é até hoje o agente antitrombótico de escolha. Estudos mostram que a heparina, bem como outros agentes antitrombóticos, estimulam de forma específica a síntese do proteoglicano de heparam sulfato (PGHS). Este PGHS tem uma atividade antitrombótica. Previamente temos demonstrado que o sítio de ligação para a heparina é a matriz extracelular (MEC), a qual deve participar de forma indireta no mecanismo de estímulo do PGHS. Assim, o presente projeto objetiva- se avaliar os mecanismos envolvidos neste processo identificando os componentes da MEC que estão envolvidos no mecanismo de estímulo da síntese de PGHS pela heparina. Foram utilizadas duas heparinas não fracionadas (Heptar® - Eurofarma e o Hemofol® - Cristália). Utilizou-se células endoteliais da aorta de coelho (BUONASSISI, 1973), cultivadas em meio Ham-F-12 enriquecido com 10% de soro feral bovino (ambos da Life Technologies) e penicilina/estreptomicina (Sigma). Estas células foram incubadas à 37ºC, sob pressão de 5% de CO 2. Para a análise dos glicosaminoglicanos, alíquotas das células e do meio de cultura foram submetidas à degradação proteolítica e, posteriormente, à eletroforese em gel de agarose. Após foram analisadas e quantificadas pela exposição do gel a um filme radiosensível, que foram submetido à varredura a laser no aparelho Cyclone. Na análises de microscopia de fluorescência, as células foram cultivadas sobre lamínula com diâmetro de 12 mm durante três dias. Então as células foram expostas à heparina por 24 horas, após foram lavadas, e incubadas com o anticorpo IgG anti-Fibronectina humana, produzida em coelho (Calbiochem – Millipore, Billerica, MA- EUA), na diluição de 1:500, em meio F-12 contendo 1% de BSA por 1 hora a 4 ºC. Em seguida, as células foram fixadas em 2% de formaldeído por 30 min, à temperatura ambiente. Posteriormente, as células foram incubadas com anticorpo secundário anti-IgG de coelho, conjugado com Texas Red (Jackson ImmunoResearch - West Grove, PA, EUA) diluídos 1:200 em PBS, durante 30 min. Ao final, as células foram incubadas por 20 min com Faloidina 1:500, e DAPI 1:1000 em PBS contendo 0,01% de saponina. FIGURA 2 - GRUPAMENTOS SULFATO E CARBOXÍLICO INFLUENCIAM NO ESTÍMULO DA SÍNTESE DE PGHS CAUSADO PELAS HEPARINAS NÃO FRACIONADAS E SEUS DERIVADOS QUIMICAMENTE MODIFICADOS. A Figura acima mostra a quantificação de Heparam Sulfato secretado para o meio de cultura, em cpm corrigidos por g de proteínas celulares. DS4- Dessulfatado por 4 horas, DS6 – Dessulfatado por 6 horas, N/O-DS – N e O-Dessulfatados, CR- carboxirreduzido. FIGURA 1- CÉLULAS ENDOTELIAIS EXPOSTAS A HEPARINA HEMOFOL (a) OU HEPTAR (b) E SEUS DERIVATIVOS QUIMICAMENTE MODIFICADOS ANALISADAS ATRAVÉS DE MICROSCOPIA CONFOCAL: Em vermelho: matriz extracelular marcada com anti-fibronectina. Em verde: citoesqueleto, marcado com faloidina. Em azul: núcleo, corado com DAPI. A- Controle. B- Exposição à heparina Hemofol/Heptar. C- Exposição à heparina Hemofol/Heptar carboxirreduzida. D- Exposição à heparina Hemofol/Heptar N-dessulfatada. E- Exposição à heparina Hemofol/Heptar O-dessulfatada. F-Exposição à heparina Hemofol/Heptar O-dessulfatada e N-dessulfatada. Resultados De acordo com os resultados, a diminuição do estímulo da síntese de PGHS poderia ser em decorrência não somente dos grupos sulfatos, ou da quantidade de cargas negativas, mas de sua localização conformacional. Além disto, as heparinas, aparentemente não induzem alterações na morfologia das células endoteliais. No entanto, foi possível observar uma sutil alteração na marcação de fibronetina, quando as células foram expostas às heparinas não modificadas. BUONASSISI, V.(1973) Sulfated mucopolysaccharide synthesis and secretion in endothelial cell cultures.Exp.Cell Res.76: BUONASSISI, V. & COLBURN, P. (1983) Antibodies to the heparan sulfate proteoglycans synthesized by endothelial cell cultures. Biochim. Biophys. Acta 760: a b A dessulfatação gradual (4 ou 6 horas) foi acompanhada pela redução do estímulo da síntese de PGHS. Já a dessulfatação total (N- e O-dessulfatado) aboliu o estímulo de PGHS. Por outro lado, a carboxiredução também levou a diminuição do estímulo da síntese de PGHS. As heparinas aparentemente, não induzem alterações na morfologia celular das células endoteliais, mesmo quando avaliado em microscopia óptica ou eletrônica de varredura. Além disto, foi possível observar uma sutil, mas não expressiva, alteração na marcação de fibronectina, quando as células foram expostas às heparinas não modificadas