TESTES USADOS EM DIAGNÓSTICO E TITULAÇÃO VIRAL

Métodos de Detecção Viral 1) Buscar o Vírus O vírus propriamente Proteínas Virais Efeitos virais in vitro Genoma Viral

1 – Investigação Direta (buscar o vírus) Microscopia Eletrônica morfologia viral Detecção do vírus (antígeno) IFA, ELISA, AGLUTINAÇÃO, etc Detecção do Genoma Viral Hibridização molecular Amplificação gênica (PCR ou derivados)

Tecidos e/ou matrizes onde se pode buscar o vírus Aspirato Nasofaringeal Vírus Respiratório sincicial Influenza A and B Parainfluenza Adenovirus Fezes Rotavirus Astrovirus Norovirus, etc Fluidos Herpes Simples HIV Esfregaços HPV, HIV Biópsias HIV, EBV, et

Microscopia Electrônica 106 partículas virais/mL são necessárias para visualização. Exemplos: Fezes ……………………Rotavirus, Adenovirus, Norovírus Astrovirus, Calicivirus Mucosas ………………….Papilomavirus (HPV)

Eletromicrografias Adenovirus Raiva Rotavirus Herpes Simples HIV Astrovírus

Imuno Microscopia Eletrônica (IME) A sensibilidade e a especificidade da ME pode ser aumentada por associação a técnicas imunológicas.  Existem duas variantes: Microscopia Eletrônica Imune Clássica (MEI) - A amostra é tratada com anti-soros específicos antes de ser analisadas no ME.   Partículas virais aglutinadas  Microscopia Eletrônica de Fase Sólida (MEIFS) - uma “grade” revestida com anticorpos específicos anti-soros é colocada em contato com a amostra. Partículas virais serão absorvidas na “grade” - pelo anticorpo.

Problemas com a Microscopia Eletrônica Equipamentos e manutenção – custos elevados Requer bastante experiência do observador Passiva de falsos negativos/baixa sensibilidade (depende da origem amostral)

BUSCAR AS PROTEÍNAS VIRAIS Testes Imunológicos: ELISA, IMUNOHISTOQUÍMICA, IMUNOFLUORESCÊNCIA CITOMETRIA DE FLUXO RADIOIMUNOENSAIO

ELISA - Ensaio Imunoenzimático O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas. O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora). A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, é feito através de leitura em fotocolorímetro.

IMUNOHISTOQUÍMICA: detecção de células infectadas em cortes histológicos (EBV, HPV)

Célula infectada por Rotavírus Símio

Citometria de Fluxo (Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)

RADIOIMUNOENSAIO (RIA): triagem do vírus da hepatite B em doadores de sangue

Investigação Indireta (buscar o efeito do vírus; isolar o vírus; atenuar o vírus) Cultura celular ou ovos embrionados: Efeito citopático (CPE) ou infecção do embrião Uso de Animais: Estudo da doença e/ou morte

Como isolar vírus. - a partir dos tecidos infectados (limitado) Como isolar vírus? - a partir dos tecidos infectados (limitado) - células em cultura - ovos embrionados CULTURA CELULAR Cultivo celular primário (derivado do tecido) 2. Cultivo em linhagens celulares semi-contínuas (Ex: fibroblastos de rins de macaco) 3. Cultivo em linhagens celulares contínuas (tumorais) - HeLa, Vero, Hep2, A549…

Todos os vírus podem ser cultivados in vitro?

Positiva para Enterovírus (4 dias) Positiva para Enterovírus (7 dias) Efeitos citopáticos clássicos  Linhagens Celulares – Visualização de Efeito Citopático Amostra ambiental Positiva para Enterovírus (4 dias) Controle Celular Controle Viral (PV) Amostra ambiental Positiva para Enterovírus (7 dias)

ATENUAÇÃO DE VÍRUS PARA PRODUÇÃO DE VACINAS

 Ensaio de Formação de Placa de Lise (Contagem em PFU) Quantificação Viral em cultura celular  Ensaio de Formação de Placa de Lise (Contagem em PFU) 1- Diluições Seriadas 2- Infecção Celular

 Ensaio de Formação de Placa de Lise (Contagem em PFU) Quantificação Viral em cultura celular  Ensaio de Formação de Placa de Lise (Contagem em PFU) 1- Diluições Seriadas 2- Infecção Celular

Desafios em Cultivos Celulares Às vezes requerem longos períodos e mais de uma passagem para obter resultados A matriz de onde provém a fonte viral pode ser um obstáculo (sangue, amostras ambientais, mucosas, fezes…) Suceptível a contaminações bacterianas e fúngicas Suceptível a substâncias tóxicas presentes na amostra Muitos vírus não são adaptados ao cutivo celular in vitro (hepatites, diarréias, papilomavírus…)

Cultivo de Vírus em Ovos Embrionados Isolamento Viral – Inoculações em Ovos Embrionados

Passagem 1 Passagem 2 Passagem 3 Passagem 4 Cultivo Celular para Isolamento e Viabilidade Viral - Vírus da Bronquite Aviária Passagem 1 Passagem 2 Passagem 3 Passagem 4

Testes de Hemaglutinação Teste rápido, fácil e barato Pode ser utilizado para detectar anticorpos para o vírus ou inibição da hemaglutinação Mede quantidade total de vírus (não somente vírus infecciosos) 27

Testes de Hemaglutinação  Alguns vírus, ou antígenos derivados de vírus, se adsorvem às hemácias através de receptores existentes na membrana destas.  Como resultado, as hemácias aglutinam, sendo este fenômeno denominado de hemaglutinação. Vírus de influenza: aglutina hemácias de galinha, cobaia, carneiro e humanas do grupo O. Vírus do Sarampo: Aglutinam hemácias de macaco. Vírus do Dengue: Aglutinam hemácias de ganso 28

TESTES DE INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO As hemaglutininas de vírus respiratórios são antigênicas e, quando um vírus infecta o organismo humano ou animal, além de anticorpos neutralizantes, há a produção de anticorpos específicos contra as hemaglutininas virais. Esses anticorpos presentes no soro são capazes de se combinar com o vírus in vitro, inibindo assim a hemaglutinação. Este é o princípio da reação de inibição da hemaglutinação, que tem grande utilidade no diagnóstico dessas infecções virais.

HIBRIDIZAÇÕES MOLECULARES Buscar o genoma viral Utiliza técnicas que identificam e/ou quantificam o genoma viral AMPLIFICAÇÃO GÊNICA HIBRIDIZAÇÕES MOLECULARES

Métodos Moleculares Mais utilizada! Métodos baseados na detecção de genoma viral, conhecido como moleculares, são muito utilizados. Mais utilizada! Busca PubMed: 20.163 publicados (últimos 8 nos) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?termpcrdiagnosisviral (Acesso em 12.03.2012) PCR Dot-blot Southern blot A especificidade depende das condições da reação (otimização)

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Amplifica a sequência alvo de DNA/cDNA, permitindo detectar o genoma viral buscado. É baseada em uma reação enzimática com uso de oligonucleotídeos que flanqueiam a sequência alvo que será aplificada pela ação da enzima DNA Polimerase. Graças a Taq Polimerase, enzima termoestável, a reação é possivel em um único MIX de reagentes; Ciclos repetidos (usualmente 25 – 40 ciclos) de desnaturação do DNA (94oC), anelamento dos oligos / primers (50oC – 65°C) e extensão dos primers (72oC) resultam em uma produção exponencial do fragmento expecífico; Atualmente a qPCR está sendo amplamente utilizada – Permite quantificar em cópias genômicas o fragmento detectável.

Esquema de PCR

VÍDEO PCR 34

Cinética da PCR A amplificação já é sub-ótima devido à limitação dos reagentes - competição dos produtos gerados com os iniciadores O pareamento dos iniciadores com a sequência que lhe é complementar já está bem facilitada, pois já existem várias cópias das sequências alvos. Os iniciadores procuram o molde na molécula de DNA, sequências que lhes são complementares 35

Reação em Cadeia da Polimerase Vantagens da PCR - Altamente sensível (pequena quantidade de material genético é requerido) - Rápida Desvantagens of PCR Passiva de contaminações Alto treinamento do manipulador Se PCR qualitativa (Resultado não quantifica) Não acessa a infecciosidade viral Relativamente custosa (25 Reais/reação) qPCR

HIBRIDIZAÇÕES MOLECULARES

Detecção de EBV em corte histológico de linfonodo com doença linfoproliferativa pós-transplante. Detecção de EBV em corte histológico de linfonodo com linfoma de Hodgkin.

Detecção de HPV por FISH (HIBRIDIZAÇÃO FLUORESCENTE)

Métodos de Detecção Viral 2) Buscar a resposta ao vírus

Investigação sorológica (buscar a resposta imune ao vírus) Detecção de de anticorpos presentes no soro  nas fases aguda (IgM) e/ou convalescente da infecção (IgG ou IgA). ELISA WESTERN BLOT CITOMETRIA DE FLUXO IMUNOFLUORESCÊNCIA

Sorologia Diagnosticando Infecções Primárias: Pelo aumento de IgG e/ou IgA (dependendo do alvo do vírus) Presença de IgM no soro indicando infecção primária Soroconversão Diagnosticando Reinfecções ou Infecções secundárias IgG ou IgA (dependendo do alvo do vírus) no soro e/ou fluidos corpóreos

Perfil Sorológico das Infecções Virais

ELISA – Ex: Teste para HIV

Western Blot Eletroforese de proteínas. Identifica antígenos ou anticorpos.

Western Blot  HIV-1 Western Blot Linha 1: Controle Positivo Linha 2: Controle Negativo A: Negativo B: Indeterminado C: Positivo

Utilidade dos Resultados por Sorologia Resposta específica ao vírus. Em caso de doenças assintomáticas a detecção sorológica (IgM e IgG) indica doença. Existem vírus que produzem efeitos clínicos após soroconversão (HIV, RAIVA).

Problemas com Sorologia Requer longos períodos para diagnosticar a infecção. Possibilidades de resultados falsos positivos (imunocomprometidos).

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