1975 - Stanley Cohen Plasmídeo

Conferencia de Asilomar - 1975 Pacific Grove - California USA - 139 cientistas de 17 nações - Recombinant DNA Advisory Commitee - RAC Normas para contenção biológica - P1  P4

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO W. Alber H. Smith D. Nathans

Ferramentas de trabalho Enzimas de restrição Sistema restrição/modificação Tipo II - utilizadas na TDR: reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos no DNA - palíndromos, atuam como verdadeiras tesouras moleculares Tipos de cortes: Produção de terminais coesivos (adesivos, protuberantes) Produção de terminais abruptos (ou cegos)

b) Clivagem simétricamente situada ao redor do eixo de simetria a) Clivagem no eixo de simetria ...TC GA... ...GAA TTC... ...AG CT... ...CTT AAG... 3 ’ 5 ’ + 5 ’ 3 ’ 3 ’ + 5 ’ 5 ’ 3 ’ Moléculas com extremidades abruptas Moléculas com extremidades coesivas

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Enzima de restrição EcoRI

A tecnologia do DNA recombinante

Ligação DNA plasmidial - vetor Fragmento de DNA - inserto LIGASE Extremidades coesivas Fragmento de DNA - inserto LIGASE

Construção do DNA Recombinante Molécula de DNA de um plasmídeo circular Molécula de DNA de um plasmídeo linear com extremidades coesivas anelamento Clivagem com enzima de restrição Ligação covalente pela DNA ligase Inserção em uma célula hospedeira Molécula de DNA plasmidial contendo o inserto

Vetores Hospedeiros Utilização clonagem Plasmídeos Bactérias / leveduras Cosmídeos Bacteriófagos Células eucarióticas Terapia gênica Virus

Tipos de Vetores Plasmídeos: são usados para clonar fragmentos de DNA de vários pares de bases a centenas de pares de bases. Bacteriófagos: são usados para clonar fragmentos de DNA de 10.000 - 20.000 pares de bases. Cosmídeos: são estruturas híbridas que possuem características do bacteriófago associadas à do plasmídeo pBR322, e são utilizadas para a clonagem dos maiores segmentos de DNA. Chromosomos artificiais para bactérias (BAC) e leveduras (YACs): podem ser usados para clonagem de fragmentos de DNA com centenas a milhões de pares de bases.

Plasmídeo pBR 322

Plasmídeo pUC 18

Bacteriófago

Plasmídeo para leveduras

Cosmídeos para leveduras

Cromossomo artificial para bactéria

Cromossomo artificial para leveduras

A tecnologia do DNA recombinante

Cortar o DNA com enzimas de restrição Fragmento 1 Fragmento 3 Fragmento 2 Fragmento 4 Inserir fragmentos em vetores Introduzir vetores em bactérias por: eletroporação ou choque térmico

Transformação bacteriana Eletroporação Transformação bacteriana

Plaqueamento