MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA CELULAR I - MICROSCOPIAS

M I C R O S P A

 Início (1600): - Incorporação do microscópio aos estudos anatômicos; - Desenvolvimento de técnicas de preparo para a visualização dos materiais biológicos 1663 Robert Hooke 1689 Marcello Malpighi 1750 1852

(1689) Introdução da microscopia à medicina Estudo de capilares Médicos: Rejeitaram microscopia – inútil Descrições sobre os capilares eram falsas Anatomia comparada era irrelevante para medicina Anatomia humana → só era útil para descrição Marcello Malpighi (1628-1694) “ Nossa opinião é que a anatomia de uma estrutura sumamente pequena, interna de uma víscera, que foi exaltada nestes tempos, é de uso a nenhum médico”

Interação da luz com o espécime Fundamento: Sistema de lentes combinadas, que são colocadas de forma a ampliarem a imagem do objeto Interação da luz com o espécime Absorção ou Refração dos raios de luz Criar contrastes entre o objeto e o meio em que envolve

Interação da luz com o espécime Na formação da imagem aos Microscópios, dois fenômenos devem ser considerados: a absorção e a refração Interação da luz com o espécime

produção de imagens aumentadas de objetos não visualizados à olho nú Microscópio  Principal instrumento da Biologia Celular e Histologia produção de imagens aumentadas de objetos não visualizados à olho nú 1) De luz (ML) / óptico (comum) Modificado (variações) com propósitos especiais  Contraste de fase  Invertido  Polarização  Fluorescência 2) Eletrônico (ME) - imagens mais aumentadas / feixe de elétrons  Microscópio eletrônico de transmissão (MET)  Microscópio eletrônico de varredura (MEV)

(lâmpada com filamento de tungstênio) Microscópio de luz comum / campo claro Componentes:  Fonte luminosa → luz branca (lâmpada com filamento de tungstênio)  Óptica → lentes ampliação condensação  Mecânica  Sistema de iluminação

Os modelos microscópicos variam na forma e no desenho

Princípios da formação da imagem ao Microscópio Fonte de luz condensadora objetiva ocular objeto Imagem I Imagem II F C Fonte de luz → Lente condensadora → Lentes objetivas → Lente ocular O posicionamento estratégico das lentes no microscópio proporcionam a formação de uma imagem Invertida

Trajeto da luz Centralização do feixe de luz “Iluminação de Köhler” Iluminação perfeita Menos ocorrência de aberrações e irregularidades no trajeto luminoso

 Ocular (es) =  imagem projetada pela objetiva  Objetiva (s) = próxima ao objeto Corrige aberrações =  qualidade da imagem Tipos: acromática, semi-apocromática, apocromática, planacromática, planapocromática Projeta imagem real e invertida Aumentos: 4x / 10x / 20x / 40x / 100x (imersão)  Ocular (es) =  imagem projetada pela objetiva Aumentos: 10x, 12x

Aumento final

Objetiva 4x = Vermelha 10x = Amarela 40x = Azul claro 100x = Preta / branca

Abertura numérico A = Ângulo de abertura da objetiva = Ângulo correspondente à metade de A AN = Abertura numérica N = Índice de refração do meio de montagem sen = Fornecido pelo fabricante da lente AN = 0,12 (4x) AN = 0,34 (10x) AN = 0,60 (40x) AN = acima de 1 (100x) AN = n.senα

Poder de Resolução X Limite de Resolução Bom microscópio: 1) Poder de Resolução (PR): “Capacidade de uma lente (ou do próprio microscópio) em formar imagens com detalhes mínimos” 2) Limite de Resolução (LR): “Menor distância entre 2 pontos distintos do objeto, que poderão ser individualizados na imagem final” > PR < LR

Quanto < o LR de uma lente > o PR do microscópio ou Quanto melhor for a capacidade de individualizar 2 pontos distintos do objeto (< LR) maior será a definição da imagem formada no aparelho ( > PR)

Planos de cortes

Planos de cortes Imagem microscópio = bidimensional Objeto de estudo = tridimensional

Observação: imagem → invertida Sequência de passos  Leia a etiqueta da lâmina material / corte / coloração Examine a lâmina macroscopicamente pode-se obter muita informação  Objetiva de menor aumento (panorâmica) Ajustar área a ser observada, centralizando-a na platina Iluminação de Köehler Objetivas de aumentos maiores Observação: imagem → invertida

Tipos de Microscópios Microscopia de Luz Microscopia convencional Microscopia de contraste de fase Microscopia de contraste interferencial Microscopia de campo escuro Microscopia de polarização Microscopia de fluorescência Microscopia confocal a laser Microscopia eletrônica Microscopia eletrônica de transmissão Microscopia eletrônica de alta voltagem Microscopia eletrônica de varredura Outros tipos de microscópio Microscopia de tunelamento quântico Microscopia de força atômica Microespectrofotometria

Microscopia de Contraste de fase Princípios da Difração da Luz Anéis metálicos colocados no caminho da luz (Zerniké, 1950) Objetivas de contraste de fase: Ph (Phase) Retardo óptico e Refração da luz

Microscopia de Contraste de fase

Aplicações da Microscopia de Contraste de fase Análise do material biológico sem coloração prévia: 1.Culturas de células 2. Exames parasitológicos 3. Esfregaços e Raspagens de mucosas (Consultórios) 4. Sangue 5. Protozoários de ambientes aquáticos 6.Algas 7. Bactérias Diferenças de índices de refração Sem coloração Cultura de células: neurônios Bactérias

Aplicações da Microscopia de Contraste de fase Análise do material com coloração prévia Esfregaço de Sangue Divisão Celular em Raiz de Cebola

Microscopia de Contraste Interferencial Prismas ópticos posicionados no caminho da luz

Microscopia de Contraste Interferencial Os prismas modificam a fase da onda luminosa Contraste com o meio em que se encontra o material

Microscopia de Contraste Interferencial Microscopia de Normarski Defasagem dos comprimentos de onda Gera uma “deformação” na imagem Permite contraste interferencial Aumentando o relevo das superfícies do material analisado

Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial Observação de materiais biológicos sem coloração: 1. Parasitologia: Interpretação de estruturas e apêndices parasitos (taxonomia) 2. Análise de massa seca celular – organização e compactação de material biológico 3. Monitoramento de culturas celulares Algas Escamas

Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial Cultura Celular: macrófago Ácaro

Princípios da formação da imagem ao Microscópio Com coloração fluorescente Sem coloração Com coloração Diferenças de índices de refração Cores de interferência Campo escuro

Microscopia de Polarização  2 Filtros / Prismas: 1º Polarizador → Entre a fonte de luz e o condensador 2º Analisador → Entre a objetiva e a ocular Promovem a seleção de apenas um plano de direção de vibração das ondas luminosas  Plano da luz polarizada (PLP) Observação: Microscopia de luz comum → feixe de ondas luminosas → direção de vibração em todos os planos

Microscopia de Polarização 2º 1º

Microscopia de Polarização 2º 1º PLP

Anisotropias Ópticas Fenômenos de ordem espectral Birrefringência (2 filtros polarizadores cruzados perpendiculares) Dicroísmo (1 filtro polarizador)

Microscopia de Polarização Filtros polarizadores, quando colocados no caminho da luz e rotacionados a 90o permitem a distinção de macromoléculas ditas anisotrópicas (birrefingentes ou dicróicas)

Componentes macromoleculares birrefringentes Outros componentes Birrefringência ocorre Cruzamos perpendicularmente os 2 filtros (polarizador e analisador) Componentes macromoleculares birrefringentes  Anisotrópicos (brilho colorido ou não) Realçados Outros componentes  Isotrópicos (não refrigentes) Indistintos em fundo escuro

Aplicações da Microscopia de Polarização 1. Análise de macromoléculas que apresentam graus ordenados de agregação: DNA, colágenos fibrilares, celulose, tubulina 2. Análise de células que apresentem organização interna de suas macromoléculas altamente cristalinas: célula muscular esquelética, espermatozóides (ordem molecular) 3. Análise de tecidos biológicos com ordem molecular nos arranjos macromoleculares: tecidos ósseos, cartilagens, dente 4. Análise de componentes cristalinos dos minerais 5. Outros: parede celular; amido.

Aplicações da Microscopia de Polarização Tecido ósseo Grãos de Amido

Birrefringência pode ser intensificada por corantes Exemplos:  Colágeno - Xylidine Ponceau - Picro-sirius  Cromatina / Matriz Extracelular - Azul de toluidina (ordem e agregação molecular ) Birrefringência pode ser intensificada por corantes

Aplicações da Microscopia de Polarização Coloração: Picro-sirius / Luz polarizada Tecido ósseo : sistema de Havers ou ósteon / fibras colágenas Tecido ósseo: osso esponjoso / fibras colágenas

Microscopia de Luz Polarizada Mesentério de rato. Coloração: Picro-sirius (fibras de colágeno: intensa birrefringência / brilhante / amarelo)

Material biológicos Birrefringência dependendo do grau de agregação de cristalinidade Medida das propriedades anisotrópicas (dicroísmo e birrefringência) Diagnósticos patológicos Estabelecimento ordem molecular Fases da vida celular

Microscopia de Campo Escuro  Os microscópios de campo escuro apresentam um tipo especial de condensador - inclina a luz de tal modo que ela não atravessa o objeto  A luz se dispersa  Apenas os feixes desviados pelo objeto percorrem o resto do sistema (objetivas e oculares)

Aplicações da Microscopia de Campo Escuro É empregada para estudos de pequenos materiais:  Plâncton  Bactérias  Cristais  Estruturas subcelular (fimbrias e flagelos)  Grãos de pólen Microscopia de campo escuro da bactéria Leptospira spp

Microscopia de Fluorescência Propriedade física de algumas substâncias absorverem a luz em um determinado comprimento de onda e emitirem luz com comprimentos de onda maiores e níveis energéticos mais baixos Microscopia de fluorescência mostrando uma célula embrionária de Caenorhabditis elegans em divisão

Fluorescência natural: Lignina de parede vegetal Existem componentes celulares ou moleculares naturalmente fluorescentes Clorofila Lignina de parede vegetal Elastina Colágeno A fluorescência visível neste nudibranqueo é dupla: os pigmentos verdes próprios da lesma e as algas vermelhas no seu intestino Algas (clorofila)

Alaranjado de acridina Outros componentes: Se ligam a substâncias fluorescentes → fluorocromos → emitem brilho contra fundo escuro Alaranjado de acridina (fluorocromo) DNA - verde RNA - vermelho Células do testículo de triatomíneos (barbeiro) Divisão celular

Microscopia de Fluorescência 1. Sistema óptico interage com pouca luz: Luz de mercúrio de alta pressão 2. Sistemas de filtros para detectar o brilho do material contra o fundo negro (a. Filtro de excitação; b. Filtro de barragem) Fonte de luz → Fótons → Filtro de excitação (seleciona os fótons de determinado comprimento) → Objeto → Emite luz fluorescente → Filtro de barragem (luz de excitação é bloqueada) → Imagem observada (formada pela luz que atravessa o filtro de barragem) b. Filtro de barragem Ocular a. Filtro de excitação Fonte de luz Objetiva

Microscopia de Fluorescência

Aplicações da Microscopia de Fluorescência Alaranjado de acridina Devido a especificidade de cada tipo de filtro e devido ao desenvolvimento de vários corantes (fluorocromos) → muitas são as utilizações da microscopia e fluorescência Fluorocromos: Alaranjado de acridina Eosina DAPI Rodamina Fluoresceina Emitem brilho contra fundo escuro

Outras aplicações da Microscopia de Fluorescência Quantificação (Fluorometria): citoquímica normal e patológica Imunofluorescência: conjugação de anticorpos a fluorocomos que permite identificação de moléculas específicas Imunocitoquímica Hibridação “in situ” (FISH)

Aplicações da Microscopia de Fluorescência

Microscopia confocal a laser  1987 - Disponível mundialmente  O microscópio confocal tem seu funcionamento baseado nos princípios da microscopia de fluorescência → Utiliza laser como fonte de luz  Permite a visualização: materiais espessos; corpos inteiros sem coloração prévia (vivos ou pré-fixados)  Reconstrução do objeto tridimensionalmente → Vários planos focais ou cortes ópticos (programas computacionais)

Aplicações da Microscopia confocal a laser 1. Todas as possibilidades já descritas para a microscopia de fluorescência convencional 2. Reconstrução 3-D de organismos microscópicos 3. Aumento de sinais de fluorescência de estruturas subcelulares. Exs: microtúbulos, miofilamentos, filamentos intermediários e elementos finos da matriz extracelular

Aplicações da Microscopia confocal a laser Células em prófase Células em apoptose: condrócitos

Aplicações da Microscopia confocal a laser Protozoário Macrófago

Aplicações da Microscopia confocal a laser Divisão celular / Fuso mitótico Grãos de Pólen

Microscopia eletrônica Semelhantes a fótons num sistema de vácuo Início: Estudos do comportamento ondulatório dos elétrons Semelhantes a fótons num sistema de vácuo Primeiros experimentos: Década de 1920 → Busch (elétrons conduzidos por lentes eletromagnéticas) 1931 → Ruska → Primeiro M.E. → Poder de resolução: 0,5 nm → 25 mil vezes a capacidade do olho humano Ernst August Friedrich Ruska (1906-1988)

Principais diferenças Microscópio de luz (ML) Microscópio eletrônico de transmissão (MET) Fonte Luz (porção inferior) Elétrons (porção superior) Lentes Vidro Eletromagnéticas Lentes de aumento (principal) Objetivas e oculares Suporte para amostra Lâmina de vidro Grade de metal (telinha)Cobre ou níquel Limite de resolução 0,2 µ 0,0002 µ Formação da imagem Transparência e coloração Variações de densidade e contrastação

Microscopia eletrônica Microscopia de Luz e Microscopia Eletrônica Questões importantes: Ampliação e Resolução

Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e de Varredura (MEV) O avanço da microscopia eletrônica se deu a partir da descoberta de que os elétrons tinham comportamento ondulatório semelhante aos fótons de luz Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET) Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)

Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)

Microscópio eletrônico Microscópio eletrônico de transmissão (MET) Microscópio eletrônico de varredura(MEV) Formação da imagem ao Microscópio eletrônico: Fonte de elétrons → Caminha por um sistema de lentes eletromagnéticas (coluna) → Feixe de elétrons → Acelerados → Lente condensadora → Amostra → Lentes objetivas (primeira imagem aumentada da amostra) → Lentes intermediarias / projetivas (formação final da imagem) → Imagem ampliada → Anteparo fluorescente / monitor

Principais etapas da preparação das amostras para MET Fixação Desidratação Inclusão Cortes Contrastação com metais pesados

Imagem final ao MET Eletrodensa (escura) → os elétrons encontram elementos como: ferro, ósmio, chumbo, ouro etc Eletrolúcida (clara) → os elétrons encontram elementos como: hidrogênio, carbono, oxigênio, nitrogênio etc Observação: Contrastação do material biológico (maioria eletrolúcidos): metais pesados

Microscopia Eletrônica de Transmissão Coloração negativa: vírus Tecido muscular Células epiteliais Cílio Hepátócito: Complexo de Golgi

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Scanning Electron Microscopy (SEM)  Revela feições topográficas da superfície (detalhes)  Imagens tridimensionais: - Vermes - Insetos - Células livres (animais/vegetais) - Embriões - Fragmentos geológicos  Elétrons secundários / refletidos na superfície da amostra Guelras de um peixe

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Preparação das amostras Fixação (glutaraldeído / tetróxido de ósmio) Desidratação Secagem (“ponto crítico”) Evaporação com ouro na superfície a ser analisada

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Title: “An Army of One" Category: Photo Microscopy Photographer: Freder Medina

Microscopia Eletrônica de Alata Voltagem ou Alta Aceleração  Descrição de estruturas subcelulares (µ) Ex.: Citoesqueleto  Aparelho grande: equivalente a um edifício de três andares - Alta aceleração eletrônica (500 a 1.000 KV) - Permite estudos de corte grossos - Reconstrução tridimensional

Microscopia de Tunelamento Quântico  Década de 1980  Potência visual do olho humano: 1 milhão de vezes (100x a capacidade do MET) = Estrutura atômica  Benning / Rohrer (1986): Prêmio Nobel de Física  Corpos: - Características ondulatórias - Emissão de energia

Microscopia de Tunelamento Quântico Agulha que dista da superfície da amostra em 1Å Percorre a superfície da amostra → corrente elétrica (tunelamento) Corrente atrai elétrons do material para a agulha → “tunel” Agulha sobre um átomo → corrente ↑ Agulha sobre os espaços entre os átomos → corrente ↓ Esses sinais (↑ e ↓) são transmitidos para o computador → imagens ≈ à superfície de vales e montanhas

Microscopia de Tunelamento Quântico Molécula de miosina Cromossomos 1 milhão de Vezes (100x a capacidade do MET) = ESTURUTRA ATÔMICA

Microscopia de Força Atômica  É semelhante ao Microscópio de Tunelamento Quântico Diferença: - Microespelho - Feixe de “laser” sobre a agulha  Menor agressividade à amostra  Detecção de detalhes de superfície Aplicações: - Imagens em solução - Sequências de reações químicas / modificações ao longo do tempo - Estrutura atômica de biomoléculas

Microscopia de Força Atômica Imagem de uma plaqueta obtida por microscopia de força atómica Imagem de eritrócitos obtida por microscopia de força atómica

Brasileiro ganha prêmio internacional para imagens de microscopia de força atômica Luciano Paulino da Silva, pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, conquistou o segundo lugar na primeira edição do Prêmio Internacional de Imagens de Microscopia de Força Atômica. A imagem de autoria do pesquisador da Embrapa, que mostra a superfície das células vermelhas do sangue depois do tratamento com peptídeos antibióticos, foi a única imagem não européia premiada dentre as mais de 250 inscritas. O prêmio visa o reconhecimento da importância das imagens de microscopia para os avanços da nanotecnologia em todo o mundo. Reportagem publicada no dia 10/09/2007

Fim Title: “Formosa Nano-Rose" Photographer: Dr. Kuei-Hsien Chen Scanning electron Microscopy – imagem representa um único cristal de Wurtzite indium nitride (InN) sintetizado Fim Title: “Formosa Nano-Rose" Photographer: Dr. Kuei-Hsien Chen Vencedor do “Science as Art Contest” de 2008