Nuclei Watershed Separation Objetivo: separar núcleos muito próximos em uma mesma imagem. Obs: o link fornece a imagem das células caso alguém queira repetir os passos. Antônio Augusto Rocha
Abra a imagem apenas arrastando- a até a barra do Fiji. A imagem tem que estar em 8 bits.
Aplique o filtro “Gaussian Blur”
Use 3.00 para o Radius (esse valor já é suficiente para que as bordas fiquem lisas, mas vocês podem tentar valores menores ou maiores dependendo do critério. Dê um OK.
A imagem ficará mais “blur”, ou seja, borrada.
Use o “threshold” para mostra ao programa o que é “background” e o que é “forground”.
Nesta janela, você deverá ajustar da melhor maneira para deixar o fundo BRANCO e o objetos a serem separados e contados PRETOS. Isso é feito clicando no botão “Dark background”. Em seguida click em “Apply”.
Agora é a hora de separar os núcleos que estão muito próximos. Aplique o plugin “Watershed”.
Linhas claras irão aparecer separando aqueles núcleos que na imagem original estavam muito próximos.
Por fim, proceda da maneira que for mais útil para você. Neste exemplo, os núcleos foram separados para em seguida serem contados.
Como discutido em aula, essa janela serve para estabelecer os critérios de inclusão do que vai ser contado (tamanho e circularidade). Uma dica: não se esqueçam de DESMARCAR a opção “Exclude on edges”, pois assim o programa pode incluir objetos que ficaram fora da contagem por estarem em planos diferentes.
Várias janelinhas irão aparecer. Janela 1- “Summary”: dá um resultado geral de todas as contagens. Janela 2- “Results”: dá os resultados individuais de cada objeto contado. Janela 3- “ROI manager”: aqui, você pode analisar individualmente cada objeto usando outros critérios, como volume, dimensão, etc..