Microscopia de contraste de fase

Microscopia de contraste de fase Contraste: diferença de iluminação entre amostras e os arredores ou o plano de fundo. Transmissão = luz + fluorescência – (absorção + refração + reflexão) fluorescência refração absorção LUZ reflexão

Microscopia de contraste de fase Tipos de contraste de fase 1) Positivo: amostra é mais escura do que o plano de fundo; 2) Negativo: amostra é mais clara do que o plano de fundo. Equação I = intensidade de luz do campo (f) ou da amostra (a). Contraste = (If - Ia) x 100 If

Microscopia de contraste de fase Tipos de amostra 1) Amplitude: alteram a intensidade da luz transmitida. Amostras transparentes coradas causam o mesmo efeito. 2) Fase: não absorvem luz, mas causam mudança de fase nos comprimentos de onda que a atravessam. Amostra transparente Amostra tipo amplitude Amostra tipo fase Amostra tipo misto (maioria)

Microscopia de contraste de fase Contraste em amostra com baixo retardo de fase ocular Plano da imagem - Os raios não desviados são retardados cerca de ¼ de l em relação aos raios não desviados; - a diferença de intensidade de luz não é percebida pelo olho humano (não dá contraste). Lente do tubo objetiva Distância focal Raios desviados amostra Raios não desviados condensador

Microscopia de contraste de fase O que o contraste de fase faz? 1) Contraste de fase positivo - Acelera os raios não desviados em ¼ de l, elevando a diferença de fase total para ½ de l; - a amostra fica escura, circundada por halo claro, sobre um fundo mais claro (menos claro que o halo). Dá contraste. 2) Contraste de fase negativo - Retarda os raios não desviados em ¼ de l, elevando a diferença de fase total para ½ de l; - a amostra fica clara, circundada por halo escuro, sobre um fundo mais escuro (menos escuro que o halo). Dá contraste.

Microscopia de contraste de fase Configuração Raios desviados 180º fora de fase não desviados + 90º Anel de fase Não desviados Raios desviados 90º fora de fase objetiva amostra Trabalha-se nos planos da imagem conoscópica condensador Anel de fase

Microscopia de contraste de fase Configuração Contraste positivo Parte central do anel mais fina que a periferia Contraste negativo Parte central do anel mais fina que a periferia

Microscopia de contraste de fase Dados técnicos Acessórios obrigatórios: anel de fase para condensador e objetivas com anéis de fase; 2) Acessório extra: filtro verde. Isto porque os o sistema é projetado para funcionar melhor no centro do espectro visível (cor verde).

Microscopia de contraste de fase Técnicas e contraste Amostra Técnica Contraste Transparente Campo claro 2-5% Corada Campo claro 25% Transparente Contraste de fase 15-20% Transparente Contraste diferencial de interferência 15-20% Transparente Campo escuro 60-75% Transparente Fluorescência 60-75%

Microscopia de contraste de fase Alinhamento dos anéis de fase Usar telescópio de fase (o mesmo usado para ver a imagem conoscópica) para ver os anéis pela ocular; Alinhar os anel do condensador movimentando os parafuso de ajuste no condensador próprio para a técnica; Sem alinhamento a técnica não funciona. Anéis não alinhados Anéis alinhados

Microscopia de contraste de fase Indicações - Amostras vivas ou fixadas não coradas; - Melhorar contraste para visualização de detalhes em amostras coradas (ex.: estriações transversais de músculos)

Microscopia de contraste de fase Limitações os halos podem obscurecer os detalhes que circundam a amostra; os anéis de fase reduzem a resolução da objetiva; não é adequada para amostras espessas.

Microscopia de contraste de fase Imagens - Células de ovário de hamster Contraste de fase positivo Contraste de fase negativo

Contraste de fase Osso compacto humano Preparo por desgaste Osso de dinossauro fossilizado com quartzo no canal de Havers Preparo por desgaste

Contraste de fase + coloração Aterosclerose (placa de colesterol na parede da artéria) Contraste de fase + coloração Pneumonia brônquica

Contraste de fase + HE Cartilagem hialina Contraste de fase + HE Língua humana

Contraste de fase + HE Neurônio multipolar Contraste de fase Pólen de plantasc