Métodos para a quantificação de proteínas Biotecnologia Prof. Priscilla Russo

Proteínas Como estudar uma proteína? Separá-la e purificá-la. 2. Determinar a sua massa molecular. 3. Determinar a sua composição e seqüência de aminoácidos. 4. Elucidar a sua estrutura tridimensional. 5. Caracterizá-la funcionalmente.

Para separar proteínas Utilizam-se diferenças nas propriedades físico-químicas das proteínas, resultantes das diferentes sequências de aa: Tamanho Solubilidade Carga Afinidade de ligação

Técnicas de separação e purificação de proteínas: Diálise, ultrafiltração, centrifugação, precipitação Cromatografia de exclusão molecular Cromatografia de troca iônica e da fase reversa Cromatografia de afinidade Eletroforese

Princípio: diferente dimensão e forma molecular Diálise A solução contendo a proteína é colocada no interior do saco de diálise, que é imerso em um grande volume de solvente Chega-se ao equilíbrio entre as concentrações dos dois meios, sendo que as proteínas continuam no interior do saco de diálise e as outras moléculas no exterior.

Ultracentrifugação Zonal A solução contendo as proteínas é colocada no topo de um gradiente de densidade. Durante a centrifugação, cada proteína se move de acordo com seu coeficiente de sedimentação. Após a centrifugação, as zonas individuais são recolhidas com auxílio de uma seringa.

Centrifugação Diferencial A centrifugação separa os componentes celulares por tamanho e densidade Componentes maiores e mais densos sedimentam (pellet) e os componentes menores e menos densos permanecem suspensos (sobrenadante).

Gradiente de Densidade

Princípio: diferença de solubilidade (precipitação) A solubilidade das proteínas varia com: pH Temperatura Força iônica Constante dielétrica do solvente

Técnicas baseadas em diferenças de solubilidade Precipitação isoelétrica (variação de pH) Salting in / salting out (variação da força iônica) Precipitação por solventes orgânicos

Salificação (salting in): a solubilidade aumenta até certo ponto, com o aumento da concentração de sal Dessalificação (salting out): os sais com concentração muito elevada retiram a água de hidratação da proteína, então as suas moléculas precipitam

Cromatografia É uma série de processos de separação de misturas. Ocorre pela passagem de uma mistura através de duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel. A grande variabilidade de combinações entre a fase móvel e estacionária faz com que a cromatografia tenha uma série de técnicas diferenciadas.

Métodos cromatográficos de separação de proteínas Diferentes tipos: Exclusão molecular Troca iônica Afinidade Fase reversa

Cromatografia de exclusão molecular Utilizado para a determinação do peso molecular de diferentes proteínas Após o empacotamento da coluna, aplica-se a amostra e é feita a eluição As moléculas maiores, que não são capazes de penetrar nos poros do gel, serão eluídas antes das moléculas menores.

Cromatografia de troca iônica As colunas são carregadas com grânulos de carga oposta, retendo as proteínas Ex: moléculas de carga negativa ficam retidas, enquanto as de carga positiva passam pela coluna

Cromatografia de Troca iônica

Cromatografia de afinidade A fase estacionária consiste geralmente de agarose ligada a brometo de cianogênio, formando uma ligação covalente. A amostra é aplicada e a proteína que possui afinidade pelo ligante se liga a ele enquanto as demais são eluídas da coluna. A proteína de interesse é então liberada da coluna, com o uso de uma substância que tenha mais afinidade pela proteína do que o ligante

Determinação da composição dos aminoácidos de uma proteína Ex: determinação da composição de aa do fragmento Ala-gly-asp-phe-arg-gly Hidrolise ácida (HCl 6N, 110ºC, 24h) Reação de revelação dos aa (ex ninidrina) Separação e quantificação dos aa (ex. cromatografia)

Separação e quantificação dos aa por cromatografia HPLC High Pressure Liquid Chromatography (cromatografia líquida de alta eficiência) Matriz de separação: utilizando diferentes propriedades físicas de cada um dos aa, ex carga, forma, hidrofobicidade Eluente: variação controlada das condições do meio Detecção: após sua derivação

Resultado de uma cromatografia de aa Integrando os picos, determina-se a quantidade relativa de cada aa, mas não a sequência

Uso da cromatografia no diagnóstico clínico Leucinose Ex.: aumento de leucina, isoleucina e valina Defeito da desidrogenase dos alfa-cetoacidos ramificados