MÉTODOS ANALÍTICOS OFF-LINE Medidas de propriedades do meio Determinação da concentração de substratos, produtos, inibidores, íons, nutrientes, etc. Métodos cromatográficos Métodos espectrofotométricos

Definição geral de cromatografia A cromatografia é um método físico-químico de separação que se fundamenta na migração diferencial dos componentes de uma mistura devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis: fase móvel (gás, líquido ou um fluido supercrítico) e fase estacionária (fixa, colocada em uma coluna ou numa superfície sólida).

1. Cromatografia em fase líquida ou Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (CLAD ou HPLC) Baseia-se na separação diferenciada dos componentes de uma solução líquida, como resultado da interação destes com uma fase estacionária

Desenho esquemático de um sistema cromatográfico (CLAD).

Desenho esquemático de um sistema cromatográfico (CLAD): a) reservatório da fase móvel; b) bomba de alta pressão; c) válvula de injeção; d) coluna; e) detector e f) registrador

Os principais componentes de um sistema cromatográfico de alto desempenho são: Coluna (local de separação) Bomba (para acionamento da fase móvel) Válvula de Injeção (entrada da amostra) Detector(es) (captação do sinal) Módulo de processamento (integrador) Módulo de registro (saída dos dados, que pode ser associado ou não ao integrador). Para a incorporação da cromatografia em fase líquida a um processo, para análises em linha, são necessários alguns módulos adicionais para remoção de amostra e filtração contínua e, dependendo do processo, diluição das amostras.

2. Cromatografia de partição ou Cromatografia Líquido-líquido A separação ocorre por partição diferenciada entre o componente na fase móvel (líquida) e o componente na fase estacionária (líquida) A fase líquida estacionária é ligada quimicamente ao material de empacotamento da coluna Pode ser de Fase Normal ou de Fase Reversa, dependendo da polaridade das fases estacionária e móvel

3. Cromatografia de adsorção ou Cromatografia Líquido-sólida Envolve a competição de componentes da amostra líquida por sítios ativos de adsorção da fase sólida das colunas Sílica é o suporte mais difundido Usada para separação de compostos orgânicos com diferentes grupos funcionais 4. Cromatografia de troca iônica Baseia-se na troca do íon da fase estacionária da coluna (resina iônica) pelo íon da amostra de mesma carga Usada para separação de compostos iônicos ou compostos altamente polares Sua grande vantagem é que todas as espécies iônicas podem ser dosadas num único aparelho

5. Cromatografia por exclusão de tamanho (Exclusão Estérica, Filtração em gel, Permeação em gel) Os componentes da amostra são separados de acordo com a sua massa molar. A retenção depende mais das dimensões da molécula que das características físicas do suporte Moléculas menores que o poro médio da fase estacionária permanecem mais tempo na coluna que as moléculas maiores. Técnica muito usada para caracterização de polímeros

6. Cromatografia em fase gasosa O principal mecanismo de separação por Cromatografia Gasosa (CG) está baseado na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária (líquida ou sólida). 1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 – Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).

B. Medidas da composição celular Praticamente todos os instrumentos disponíveis para biorreatores medem propriedades físicas e químicas do meio Embora estes parâmetros reflitam a presença e a atividade das células no biorreator, eles não fornecem informações sobre o estado dos microrganismos Tais informações são essenciais por várias razões, e a mais importante é o desenvolvimento e o controle do processo Isto é especialmente significativo para cultivos em que o produto de interesse se acumula no interior da célula Os métodos de análise off-line são pouco úteis para controle de processo, pois o tempo em que ocorrem as mudanças no biorreator é menor que o tempo necessário para as análises Assim, são desenvolvidos métodos em linha ou quasi em linha, para determinação dos componentes ou características celulares

1. Citometria de fluxo

2. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) Baseia-se na ressonância de certos núcleos atômicos quando colocados num campo magnético de alta resistência e expostos à radiação eletromagnética de alta frequência. A frequência de ressonância é uma função do tipo de núcleo e do campo magnético local a que ele está exposto. Assim, por exemplo, o fósforo no ATP pode ser diferenciado do fósforo no NADPH.

Este espectrômetro permite analisar núcleos de próton (1H), carbono-13 (13C), fósforo-31 (31P), dentre outros, presentes em amostras dissolvidas em solventes deuterados em tubos de ressonância de 5 mm e 10 mm de diâmetro.

3. Análise por Injeção em Fluxo (FIA) Não corresponde a um instrumento propriamente dito, mas sim a um sistema analítico Muitos sensores não podem ser utilizados diretamente no fermentador por problemas de aderência de células, interferência química de componentes do meio, interferência elétrica, requisitos de calibração ou porque não podem ser esterilizados Esses problemas podem ser superados analisando-se um fluxo de amostra retirado do fermentador, como no o caso do sistema FIA Corresponde a um método quasi em linha