Teste de Esterilidade Ana Maria Milani RA 058855 Bruna Fernandes Mendes Silva RA 059257 Celene Yukimi Kubo RA 059713 Érika Domingos Silva RA 060438 Gisele Maria Metta RA 061160

Roteiro Introdução Conceitos Materiais e Métodos Aplicações Conclusão Referências

Introdução Esterilidade - total ausência de formas viáveis de MO capazes de reprodução.

Introdução Conhecimento atual - questionamentos quanto à afirmação absoluta da esterilidade dos produtos; Ausência total de microrganismos: não factível matematicamente.

Introdução Terapêutica parenteral - origem no século XIX; Primeiro método oficializado de teste de esterilidade – Inglaterra (1932): teste em produtos sob a forma liquida, mediante utilização do caldo peptonado e incubação a 37°C durante 5 dias, a fim de detectar bactérias aeróbicas.

Introdução Teste de esterilidade: visa verificar com mais segurança a qualidade do processo esterilizante, empregado durante a fabricação de medicamentos estéreis, bem como manipulações assépticas, levando-se em consideração respectivamente o aspecto probabilístico da esterilização e o risco da contaminação.

Introdução Limitações do teste de esterilidade: problemas microbiológicos e dificuldades na obtenção de amostras representativas de um determinado lote; Afirmar esterilidade absoluta de um produto exigiria que todas as suas frações fossem submetidas ao teste, o que não é aplicável.

Introdução Teste busca proporcionar condições ideais ao desenvolvimento de bactérias, bolores, e leveduras. Não abrange condições que permitam o crescimento de vírus - quando há ausência de bactérias e fungos extrapola-se o resultado negativo também aos vírus. Dois problemas principais nos testes de esterilidade: 1) tamanho da amostra a ser empregada; 2) condições de recuperação dos microrganismos

Tamanho da amostra Teste do tipo destrutivo - não pode ser aplicado a todo o lote; Método estatístico de amostragem - determinado pelo n° de amostras tomado e incidência de contaminação do lote. O n° de unidades a ser testado depende do tamanho do lote e do tipo do produto.

Tamanho da amostra Probabilidade de aprovar um lote contaminado diminui com aumento do tamanho da amostra; Probabilidade de se aprovar um lote problema aumenta à medida que o índice de contaminação diminui; Tamanho da amostra - estabelecido arbitrariamente, e não fornece uma população estatisticamente significante para estimar esterilidade.

Condições de Recuperação   Identidade de todos os potenciais contaminantes é desconhecida - comprometimento na escolha do meio de cultura, temperaturas e tempos de incubação; Escolha destes meios – questionável. Sugere-se que uso de meio sólido ao invés de líquido seria mais apropriado.

Condições de Recuperação Produtos oleosos: células microbianas podem estar na matriz do produto - necessário extração com um solvente adequado, ou propiciar o contato do contaminante com fatores nutricionais do meio de cultura.

Condições de Recuperação Produtos com componentes (conservantes) que apresentem atividade antimicrobiana – inativação por diluição ou pela adição de inativador específico ao meio de cultura; MOs expostos a antimicrobianos - agredidos de forma sub-letal. Teste de esterilidade não incorpora mecanismo de recuperação, mas permite tempo para a sua restauração.

Outros Pontos Críticos Evitar contaminação da amostra sob teste.

Outros Pontos Críticos Condições de Trabalho - qualidade do ambiente de execução do ensaio deve ser muito bem controlada e conhecida, a fim de evitar resultados falso-positivos.

Outros Pontos Críticos Preparo da Amostra - desinfecção da superfície externa dos frascos, ampolas, ou outros materiais de acondicionamento e ou embalagem, com soluções anti-sépticas; Tempo de contato determinado experimentalmente frente aos contaminantes + prováveis de estarem presentes nas amostras. Eficiência destas soluções - comprovada periodicamente. No final - perfeita remoção deste agente químico.

Outros Pontos Críticos Armazenar unidades em ambiente apropriado, e violá-las no momento da inoculação aos meios de cultura ou da dissociação ou diluição nos líquidos diluentes; Cuidados de identificação das amostras - não provocar misturas, principalmente entre lotes diferentes do mesmo produto.

Meios de Inoculação Inoculação Inoculação Direta Inoculação Indireta

Inoculação Há 2 possibilidades de inoculação da amostra no meio de cultura: Direta Indireta Técnica escolhida depende de diversos fatores: facilidade e disponibilidade da circunstância, a eficiência desejada e as limitações de ordem econômica. Para qualquer forma de inoculação da amostra é importante que se avalie e comprove a sua não interferência ocasionando resultado falso-negativo.

Inoculação Direta Utilizado desde a oficialização inicial da prova de esterilidade em 1932; Consiste na inoculação de quantidades ou volumes pré-estabelecidos da amostra em volumes estipulados de diversos meios de cultura, tanto na forma líquida, quanto na semeadura da amostra em nutriente sólido.

Inoculação Direta Farmacopéias  alíquotas devem ser transferidas para o meio de cultura, a partir de cada unidade integrante da amostra representativa do lote; Se o volume pequeno (de 0,5 a 1,0 mL) é recomendável que toda a quantidade existente seja analisada; Se o volume for maior  apenas uma quantidade parcial será analisada.

Suas Vantagens Simplicidade; Seu histórico de uso; Fácil execução requer pouco treinamento; Necessidade de pouca manipulação; Baixo nível de contaminação ambiental. De acordo com a natureza da amostra  exigência de alguns recursos intermediários  resultado do teste seja válido.

Suas Desvantagens Baixa representatividade da amostra; Consumo elevado de meios de cultura e vidrarias; Possibilidade de geração de resíduos de agentes inibitórios; Tempo de incubação necessário; Restrição para volumes a partir de 100mL; Interferência da turbidez do produto.

Inoculação Indireta Introduzida em 1957 por Holdowsky; Baseia-se no tratamento prévio da amostra com solubilização ou lavagem em líquidos fisiológicos, seguida de filtração esterilizante e inoculação da membrana filtrante ao meio de cultura; O produto a ser testado não entra em contato com o meio de cultura.

Membrana Filtrante Composição: ésteres de celulose, ou materiais sintéticos que resistam a produtos agressivos; Diâmetro de 47mm, com borda hidrofóbica, e com um tamanho de poro de 0,45 ± 0,02µm; Requisito primordial: satisfaça aos testes de retenção microbiana e também de integridade.

Suas Vantagens Maior representatividade estatística; Redução de falso-negativos; Redução no consumo de meios de cultura; Abrangência a produtos com volumes de 1 mL até 5L.

Suas Desvantagens Maior nível de manipulação e preparações prévias; Exigência de maior treinamento técnico; Não aplicável em suspensões, óleos, cremes e pomadas não solubilizáveis; Aumenta o risco de falso-positivo.

Meios de Cultura Não é do conhecimento do analista qual é o contaminante viável residual ou agente de recontaminação do produto antes de efetuar o ensaio. Requer meios não-seletivos, para crescimento de diversos tipos de microorganismos.

Meios de Cultura Forma líquida; Ao menos 2 tipos diferentes: meio para aeróbios e para anaeróbios; Pode-se usar mais de 2 meios, visando crescimento diferenciado.

Meios de Cultura Introdução inicial da metodologia  1932 Diversos nutrientes propostos e adotados ao longo das revisões das farmacopéias.

Meio Tioglicolato Composição: Hidrolisado pancreático de caseína 15 g Extrato de leveduras (solúvel em água) 5 g Glicose monoidratada/anidra 5,5g/5.0g Cloreto de sódio 2,5 g L-Cisteína 0,5 g Tioglicolato de sódio Solução 0,1% de resazurina de sódio 1 mL Agar granulado (umidade não mais que 15%) 0,75 g Água purificada 1000 mL Polisorbato 80 (opcional) 5 mL

Meios de Cultura – Aeróbios USP XVIII introduziu o emprego do meio de caseína-soja. Detecção de bactérias aeróbicas e psicrófilas, podendo abranger também fungos.

Meio Caseína-Soja Composição: Hidrolisado pancreático de caseína 17 g Hidrolisado de soja por papaína 3 g Glicose monoidratada/anidra 2,5 g / 2,3 g Cloreto de sódio 5 g K2HPO4 2,5 g Água purificada 1000 mL Polisorbato 80 (opcional) 5 mL

Meios de Cultura - Fungos Seletividade questionável do caldo caseína-soja para com bolores e leveduras. Recomendação da utilização do meio de Sabouraud devido a sua conhecida seletividade para fungos.

Meio Sabouraud Composição: Hidrolisado pancreático de caseína 5 g Hidrolisado péptico de tecido animal Glicose 40 g Ágar 23,5 g

Meios de Cultura Deve-se verificar a capacidade promotora de crescimento dos meios  verificação, ao menos, a cada lote de meio. Neste teste: inoculação de 10 a 100 microorganismos viáveis, podendo ser de Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida albicans, Clostridium sporogenes, Bacteroides vulgatus, Plectridium sphenoide etc. Incubar todos os tubos nas condições idênticas do teste a ser executado com as amostras e observar o aparecimento de turvação até o sétimo dia.

TEMPO E TEMPERATURA DE INCUBAÇÃO

Tempo de Incubação O primeiro método oficial, de 1932, recomendava tempo de incubação de 5 dias. No decorrer das revisões farmacopeicas houve mudanças, passando a se adotar período de 7, 10 e 14 dias. USP XXIV, de 2000, oficializou o período de incubação de 14 dias.

Tempo de Incubação Atualmente, há 2 tendências: 1) Farmacopéicas; 2) Delegar ao fabricante o estabelecimento do tempo de incubação, uma vez que este é quem melhor conhece as características do seu produto e as condições de produção do mesmo.

Tempo de Incubação Em quase todos os casos, o microorganismo contaminante encontra no produto farmacêutico condições adversas, muitas vezes mantendo a viabilidade sob a forma esporulada, o que exigiria cuidados quanto ao tempo de incubação das amostras para evitar resultado falso-negativo.

Temperatura 30º a 37ºC para o meio de tioglicolato 20º a 25ºC para outros

INTERPRETAÇÃO DO TESTE

Interpretação Observação macroscópica do crescimento microbiano, manifestado sob a forma de turvação do meio líquido ou aparecimento de colônias no meio sólido.

Interpretação

Aplicações Injetavéis Preparações oftálmicas Soluções parenterais Implantes Materiais médico-hospitalares

Aplicações Métodos manuais Equipamentos automatizados

O BacT/ALERT 3D Sistema de detecção microbiana automatizada com tecnologia de ponta; O equipamento, através de um sensor,detecta as mudanças de cor decorrentes da formação de CO2, gerado por mircrorganismos.

Vantagens Alta capacidade de recuperação; Resultados rápidos, metade do tempo do teste convencional; As amostras não são destrutíveis; Detecta os microrganismos positivos e determina os negativos mais rapidamente do que com os métodos convencionais; Reduz o trabalho do laboratório; Os frascos são continuamente agitados e a temperatura controlada;

Indicadores de Esterilização Assegurar a eficiência do processo esterilizante; Os indicadores biológicos são os mais aconselhados; Os indicadores biológicos ou bioindicadores, consistem em cepas de microrganismos na forma esporulada, de alta resistência ao processo esterilizante; A inoculação dos bioindicadores deve ser feito no próprio produto para simular a condição em que se encontraria o contaminante natural.

Indicadores Biológicos Calor úmido: Bacillus stearothermophilus; Radiação: Clostridium sporogenes, Strptococcus faecium, Bacillus sphericus, Bacillus pumilus e Micrococcus radiodurans; Óxido de etileno: Bacillus subtilis var. niger.

Terezinha de Jesus A. Pinto REUTILIZAÇÃO SIMULADA DE PRODUTOS MÉDICO-HOSPITALARES DE USO ÚNICO, SUBMETIDOS À ESTERLIZAÇÃO COM ÓXIDO DE ETILENO Mônica Valero da Silva Terezinha de Jesus A. Pinto Faculdade de Ciências da Saúde, Departamento de Farmácia, Fundação Universidade de Brasília Departamento de Farmácia,Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo

Eletromicrografia de varredura da superfície externa do balonete de tubo de traqueostomia mostrando presença de Bacillus subtilis. Eletromicrografia de varredura da superfície interna de cateter intravenoso, mostrando aglomerado de Bacillus subtilis. . Eletromicrografia de varredura da superfície interna de torneira três vias, com presença de Bacillus subtilis.

Conclusão: Estufa não se demonstrou efetiva na esterilização, 12% apresentou irregularidades.

Conclusão Evolução da técnica; Etapas críticas: amostragem, temperatura de incubação; Método não é totalmente abrangente; Garantia da Qualidade Papel do farmacêutico: Novas Metodologias

Bibliografia Terezinha de Jesus Andreoli Pinto; “Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos”; 2ª edição, Ateneu Editora São Paulo, 2003. Jeanne Moldenhauer and Scot VW Suton; “Towards an Improved Sterility Test”; PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology; Vol. 58, N° 6, 2004. http://www.biomerieux.com.br – Acessado em 01/10/09 Mônica Valero da Silva, Terezinha de Jesus A. Pinto; “Reutilização simulada de produtos médico-hospitalares de uso único, submetidos à esterilização com óxido de etileno”; Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, vol. 41, n. 2, abr./jun., 2005. Maria Emiliana Magalhães Prado, Silvana Soléo Ferreira dos Santos, “Avaliação das condições de esterlização de materiais odontológicos em consultórios na cidade de Taubaté”; Rev. biociênc.,Taubaté, v.8, n.1, p.61-70, jan.-jun.2002. USP (United States Pharmacopeia) 30 – NF 25 - volume 1 - <71> Sterility Tests