SO 4 – Grupo 2 26 de Outubro de 2011 M ÉTODOS DE EXTRAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS.

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1 SO 4 – Grupo 2 26 de Outubro de 2011 M ÉTODOS DE EXTRAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS

2 Objectivos 1) Analisar diferentes métodos para extracção de lípidos em amostras biológicas 2) Discutir diferentes métodos de análise de lípidos, incluindo a sua identificação 3) Explicar exemplos do estudo de lípidos para o diagnóstico em Medicina. 2 SO 4 – Grupo 2 | 26 de Outubro de 2011

3 Fraca solubilidade na água Grande solubilidade nos solventes orgânicos (polares ou apolares) São maioritariamente: - Ésteres de ácidos gordos - Amidas de ácidos gordos Principal meio de separação intra/extracelular Lípidos 3 SO 4 – Grupo 2 | 26 de Outubro de 2011

4 LÍPIDOS RESERVA (LÍPIDOS APOLARES) TRIGLICERÍDEOS MEMBRANARES (POLARES) FOSFOLÍPIDOS GLICERO- FOSFOLÍPIDOS ESFINGO- LÍPIDOS ESTERÓIS EX : COLESTEROL GLICOLÍPIDOS ESFINGO- LÍPIDOS Esfingosina Ácido gordo Mono- ou oligossacarídeo Glicerol Ácido gordo PO 4 Álcool Ácido gordo PO 4 Álcool Esfingosina Glicerol Ácido gordo 4

5 Preparação das amostras para extracção 1. Evitar condições oxidantes na armazenagem Oxigénio, luz e temperatura 2. Pré-secagem  Secagem em estufa de vácuo ou liofilização  Melhora a moagem da amostra  Quebra emulsões lípido-água  Evita a saturação do solvente orgânico em água  Alta temperatura promove ligações de lípidos c/ proteínas e CH 5 SO 4 – Grupo 2 | 26 de Outubro de 2011

6 Preparação das amostras para extracção 6 3. Moagem Tamanho de partícula afecta rendimento de extracção Para materiais muito ricos em gordura pode ser feita com o alimento congelado 4. Hidrólise ácida Importante em lacticínios, cereais e derivados e produtos animais SO 4 – Grupo 2 | 26 de Outubro de 2011

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8 Com Solvente Extracção Contínua Extracção de Alta Pressão Método de Bligh- Dyer 8 Sem Solvente Métodos de Babcock e de Gerber Métodos de extracção SO 4 – Grupo 2 | 26 de Outubro de 2011

9 9 É um método que utiliza refluxo de solvente para extracção; O processo de extracção é contínuo e, portanto, mais rápido; Pode ser utilizado somente com amostras sólidas; Tem a desvantagem do contacto do solvente muito quente com a amostra, que pode levar à degradação da gordura; Tem a vantagem de utilizar menos solvente e ser mais rápido,(a amostra está permanentemente em contacto com o solvente.). % Lípidos = massa final balão – massa inicial balão x 100 massa amostra Cálculo do Teor Lípidico: SO 4 – Grupo 2 | 26 de Outubro de 2011

10 10 1. Pesagem da Amostra 2. Extracção de Lípidos com Solvente (aprox. 8h no extractor) 3. Evaporação do Solvente 4. Pesagem da Gordura Extraída 5. Cálculo de Teor Lípidico SO 4 – Grupo 2 | 26 de Outubro de 2011

11 11 Desvantagem: necessidade de elevadas pressões, o que requer equipamentos especializados e dispendiosos. Com fluidos supercríticos: Qualquer fluido, quando é submetido a pressões e temperaturas acima do seu ponto crítico, torna-se supercrítico. Algumas das propriedades dos fluidos passam a assemelhar-se às de alguns gases e líquidos (a densidade é idêntica à dos líquidos, a viscosidade à dos gases, etc.) Estes novos fluidos difundem-se mais facilmente pelos sólidos, o que aumenta o seu rendimento nas extracções. SO 4 – Grupo 2 | 26 de Outubro de 2011

12 12 A extracção é a frio; Pode ser usado para qualquer tipo de amostra (seca ou húmida). Utiliza uma mistura a frio de três solventes: clorofórmio-metanol-àgua. A amostra é misturada com metanol e clorofórmio que estão numa proporção que forma uma só fase com a amostra Adiciona-se mais clorofórmio e água de maneira a formar duas fases distintas, A fase de clorofórmio com a gordura é isolada e, após a evaporação do clorofórmio, obtemos a quantidade de gordura por pesagem. SO 4 – Grupo 2 | 26 de Outubro de 2011

13 13 O método de Gerber é utilizado para determinar o conteúdo em lípidos do leite e outras substâncias; O método de Gerber é especialmente utilizado na Europa, enquanto o semelhante método de Babcock é usado principalmente nos Estados Unidos, sendo que o método de Gerber é 2 a 3 vezes mais rápido que o de Babcock; Os lípidos do leite são separados das proteínas adicionando ácido sulfúrico. A separação é facilitada usando álcool amílico e recorrendo ao processo de centrifugação. O conteúdo em lípidos é lido directamente do recipiente de medida. SO 4 – Grupo 2 | 26 de Outubro de 2011

14 Q UAIS OS DIFERENTES MÉTODOS DE ANÁLISE DE LÍPIDOS ? 14 Cromatografia Gasosa Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Cromatografia em Camada Fina (TLC) SO 4 – Grupo 2 | 26 de Outubro de 2011

15 O ESTUDO DE LÍPIDOS E O DIAGNÓSTICO EM M EDICINA Importância da extracção de Lípidos: 1) Padrões de Identificação e rotulagem (na análise do teor lipídico dos alimentos); 2) Investigação e Diagnóstico:  Identificação e/ou caracterização de diferentes lípidos de uma amostra;  Efeito das gorduras e dos óleos sobre as propriedades funcionais e nutricionais dos alimentos;  Quantificação de lípidos no plasma;  Concluir perante alguns valores anormais registados em análises feitas ao sangue dos pacientes. Portanto, para podermos detectar uma anomalia e fazer um diagnóstico temos que, em primeiro lugar, saber quais os valores normais de concentração destas biomoléculas no sangue. 15 SO 4 – Grupo 2 | 26 de Outubro de 2011

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17 Doenças do Sistema Nervoso Central Alteração/des regulação do metabolismo lipídico. Aqui se encontra a segunda maior concentração de lípidos. Distúrbios neurológicos. Doenças Neuro- degenerativas. Alzheimer Parkinson Niemann-Pick Bipolaridade Esquizofrenia SO 4 – Grupo 2 | 26 de Outubro de 2011

18 Hipercolesterolemia Familiar Doença génética Níveis anormalmente altos de colesterol no sangue (>300 mg/dL) Risco elevado de aterosclerose e doenças coronárias prematuras. Causada por mutações em pelo menos três genes diferentes. Deficiência no transporte e metabolismo do colesterol Angina de Peito Enfarte de Miocárdio SO 4 – Grupo 2 | 26 de Outubro de 2011

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20 Bibliografia  Propriedades dos lípidos  Nelson & Cox, Lenhinger Principles of Biochemistry, 4ª Ed, 2004, Capítulo 11  STRYER, Lubert; TYMOCZKO, John L.; BERG, Jeremy M. – Bioquímica – 5ª Ed, 2004  Métodos de extracção e análise  http://www.cyberlipid.org/extract/extr0001.htm http://www.cyberlipid.org/extract/extr0001.htm  http://www.lipidlibrary.co.uk/topics/extract/index.htm http://www.lipidlibrary.co.uk/topics/extract/index.htm  http://jacintocastanho.planetaclix.pt/cromatografia.htm http://jacintocastanho.planetaclix.pt/cromatografia.htm  http://www.infopedia.pt/$cromatografia http://www.infopedia.pt/$cromatografia  http://www.cyberlipid.org/cyberlip/home0001.htm http://www.cyberlipid.org/cyberlip/home0001.htm  http://www.cyberlipid.org/cyberlip/home0001.htm http://www.cyberlipid.org/cyberlip/home0001.htm  http://www.apmaldi.com/Applications/Spectra/Lipids_Spectrum2.jpg http://www.apmaldi.com/Applications/Spectra/Lipids_Spectrum2.jpg  http://www.dq.fct.unl.pt/cadeiras/bio-A/main/aula09_08_09(lipidos).pdf http://www.dq.fct.unl.pt/cadeiras/bio-A/main/aula09_08_09(lipidos).pdf  http://www.dqb.fc.ul.pt/docentes/fduarte/espectrometria_de_massa_de_elect.htm http://www.dqb.fc.ul.pt/docentes/fduarte/espectrometria_de_massa_de_elect.htm  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12069422?dopt=Abstract http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12069422?dopt=Abstract  Diagnóstico e doenças  http://www.cyberlipid.org/cyberlip/home0001.htm http://www.cyberlipid.org/cyberlip/home0001.htm  http://www.ess.ips.pt/escola/Bioquimica/8CLE/GRUPO9/9.8.pdf http://www.ess.ips.pt/escola/Bioquimica/8CLE/GRUPO9/9.8.pdf  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12069422?dopt=Abstract http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12069422?dopt=Abstract 20 SO 4 – Grupo 2 | 26 de Outubro de 2011

21 Alunos Ana Luísa Rodrigues Berta Hespanha Emanuel Martins Filipe Mateus Joana Martinho João Facas João Luís José João Luís Melo Marta Martins Sofia Martins 21 SO 4 – Grupo 2 | 26 de Outubro de 2011