Universidade Federal de Pelotas Centro de Biotecnologia

Apresentação em tema: "Universidade Federal de Pelotas Centro de Biotecnologia"— Transcrição da apresentação:

1 Universidade Federal de Pelotas Centro de Biotecnologia
Caracterização molecular de isolados de leptospira Odir Antônio Dellagostin, Ph.D.

2 TAXONOMIA 19 espécies genômicas >250 sorovares Intermediárias
Patogênicas Leptospira fainei Leptospira broomii Leptospira inadai Leptospira licerasiae Leptospira interrogans Leptospira weilii Leptospira borgpetersenii Leptospira noguchii Leptospira santarosai Leptospira alexanderi Leptospira kirschneri Leptospira genospecies 1 Leptospira wolffii Saprófitas Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachii Leptospira genospecies 3 Leptospira genospecies 4 Leptospira genospecies 5

3 Caracterização sorológica x molecular
Baseada na reação antígeno x anticorpo Detecta variações antigênicas (proteínas, mas principalmente LPS) Difícil de ser realizada pois requer bateria de soros bem caracterizados Só realizado em centros de referência

4 Caracterização sorológica x molecular
Caracterização molecular Baseada no DNA Detecta variações na seqüência de nucleotídeos ou no tamanho de fragmentos de DNA Requer apenas equipamentos comuns de biologia molecular Pode ser realizada em qualquer laboratório

5 Principais técnicas de caracterização molecular
Seqüenciamento de DNA Pulsed Field Gel Electrophoresis – PFGE Variable Number of Tanden Repeats – VNTR Multi Locus Sequence Typing – MLST

6 Seqüenciamento do gene 16S rDNA

7 Extração de DNA e PCR Leptospira interrogans meio EMJH Extração de DNA

8 Seqüenciamento de DNA

9 (Fonte: Morey et al., 2006)

10 PFGE Eletroforese em Campo Pulsado Equipamento DNA Bacteriano
Princípio

11 Resultado de uma análise por PFGE
Eletroforese de DNA de diferentes amostras Árvore Filogenética

12 PFGE

13

14 VNTR VNTR 7 VNTR 4 VNTR 19 VNTR 10 VNTR 9 VNTR 2 VNTR 11

15 Caracterização Molecular
VNTR

16 VNTR M A B A B CÓPIAS 5 2 Eletroforese 250 pb 100 bp VNTR 1= 50 pb
Por lo laborioso, dos tecnicas para sustituir VNTR 1

17 VNTR

18 VNTR de isolados brasileiros de L. interrogans
N° ordem Origem do isolado VNTR7 VNTR10 VNTR19 Tipificação VNTR (sorovar) 1 Canino - Canis familiaris (M5/90) 7 2 Icterohaemorrhagiae Canino - Canis familiaris (M12/90) 10 3 Canicola Canino - Canis familiaris (M5/91) 4 Humano - Homo sapiens (M21/96) 5 Rato - Rattus norvegicus (M9/99) 6 Rato - Rattus norvegicus (M11/99) Rato - Rattus norvegicus (M10/99) 8 Canino - Caninus familiaris (LO1) 9 Canino - Caninus familiaris (LO2) Canino - Caninus familiaris (LO5) 11 Canino - Caninus familiaris (LO6) 12 Canino - Caninus familiaris (LO8) 13 Canino - Caninus familiaris (LO11) 14 Canino - Caninus familiaris (LO12) 15 Suíno- Sus scrofa domestica (L03) 16 Suíno- Sus scrofa domestica (L04)

19 VNTR de isolados de Pelotas

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22 MLST – Multi Locus Sequence Typing

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28 (Ahme et al., 2006)d

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30 Conclusão Seqüenciamento do gene 16S rDNA – Permite a identificação da espécie. PFGE – Possibilita a identificação do sorovar na maioria dos casos. Difícil de ser realizada. VNTR – Permite a identificação de sorovar, porém apenas de L. interrogans. MLST – Técnica mais aprimorada. Permite a diferenciação de isolados de um mesmo sorovar. Ideal para o estudo de surtos.

31 Universidade Federal de Pelotas
Centro de Biotecnologia Grupo de pesquisa em leptospirose CPqGM – Fiocruz - BA Albert Ko Alan McBride Flávia da Cruz - UFBA UFPel – Centro de Biotecnologia Odir A. Dellagostin Éverton F. da Silva Fabiana K. Seixas Sandra D. Jouglard José Antônio Aleixo Gustavo Cerqueira Daiane Hartwig Karine Forster Danieli Hartmann Michel Fagundes André Grassmann Bio-Manguinhos - Fiocruz Marco Medeiros Ana Paula Argondizzo FMVZ - USP Silvio A. Vasconcellos Fabiana Miraglia UFF Walter Lilenbaum UFPel – CCZ Claudiomar Brod Cláudia Fernandes Financiamento Bio-Manguinhos (Fiocruz CNPq, CAPES, NIH

32 Muito obrigado! odir@ufpel.edu.br www.ufpel.edu.br/cenbiot