GENOMA E NUTRIÇÃO CLAUDIA MARIA MEIRELLES MARCHINI.

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1 GENOMA E NUTRIÇÃO CLAUDIA MARIA MEIRELLES MARCHINI

2 Genoma É a informação genética pertencente a uma célula ou um organismo Genoma humano apresenta aproximadamente 25 mil genes É o conjunto de cromossomos das células. Nos possuimos 23 pares de cromossomos no núcleo. Quem carrega essa informação é o DNA

3 Projeto Genoma humano Mapeamento do genoma humano
Identificação dos nucleotídeos Aproximadamente 1,5% do genoma codificam proteínas Seqüências genoma que não codificam proteínas consistem RNA, seqüências regulatórias, íntrons e “junk” DNA Completado em O que o término do genoma humano trouxe? Permitiu elucidar funções dos genes, bem como a caracterização de suas interações com fatores ambientais!! Junk DNA = sequencia do cromossomo ou genoma que não teria função. Atualmente existem sequencias que possuem funcao e outras que estao sendo estudadas = varias hipoteses e RNA nao codificantes.

4 Ômicas: novas ciências
* Genoma * Transcriptoma * Metaboloma * Nutrogenoma * Proteoma A era pós-genômica possibilitou estudos em larga escala com novas ferramentas. Surgiram outras linhas de pesquisa. Genomica genes e informacao, é o estudo das funções de todos os genes do genoma, incluindo suas interações com fatores ambientais, Genoma se modifica lentamente ao longo de gerações. transcritoma mRNA. Metabolomica. Já o transcritoma, o proteoma e metanoloma sofrem alterações constantes em respostas a fatores ambientais, incluindo alimentação. É nesse contexto que a nutrigenomica surgiu! É uma área chave para a nutrição! As perguntas que essa ciencia quer responder sao: Como a nutrição influencia o metabolismo? Como o genoma individual responde a doenças metabolicas? Desenvolvimento de estratégias dietéticas para a saúde para evitar doenças relacionadas com a dieta. As expectativas com o desenvolvimento da nutrigenômica são altas, porém muito lentas. As tecnologias genômicas são caras. Como o nutriente afeta o genoma, o proteoma, o metaboloma? * Lipidoma Outras Ômicas…

5 Interação Nutriente – Gene
Objetivo: estabelecer dietas personalizadas com base no genótipo para promover a saúde diminuindo os riscos de doenças crônicas (cardiovasculares, diabetes, câncer...) É fundamental a aplicação na área da nutrição das ferramentas da genômica funcional para a análise do transcritoma, do proteoma e do metaboloma. Aplicabilidades: cultura de células, modelos experimentais em animais, estudos pré-clínicos e clínicos

6 Ciências Nutricionais
Galactosemia é um defeito genético na enzima GALT, levando a um acúmulo de galactose no sangue Fenilcetonúria é um defeito genético na enzima fenilalanina-hidrolase, levando a um acúmulo de fenilalanina Deficiências de vitaminas como a B12, ácido fólico, B6, C, E, ferro ou zinco causam dano no DNA quebrando a dupla-fita A deficiência de nutrientes pode explicar porque ¼ da população dos Estados Unidos que não consome as 5 porções diárias recomemdadas de vegetais e frutas tem um risco 2 X maior de desenvolverem câncer No início do século XX a ciencia nutricional era voltada para a acao de vitaminas e minerais definindo o uso e prevenindo doencas que a sua falta causava. Como os problemas de saude modificaram para a supernutricao, obesidade o foco das estudos nutricionais tambem mudou. Galactosemia: Conceito antigo conhecido desde Causa até retardo mental. Precisa ser diagnosticado em criancas logo apos o nascimento e o tratamento é uma dieta com baixos niveis de lactose. Essa doença é causada por um gene. Muitas doenças porem possuem uma natureza poligenenica. Os danos causados no DNA pela deficiencia de vitaminas é semelhante aos danos causados pela radiacao No início do século XX a ciência nutricional atuava na prevenção de doenças causadas pela deficiência de vitaminas e mineraisEpidemiologia e fisiologia Atualmente as mudanças de hábitos alimentares e problemas nutricionais levaram a supernutrição, obesidade, diabetes…Foco: biologia molecular e genética

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8 Nutrigenômica “Caracteriza uma nova visão do estudo de alimentos e da pesquisa nutricional na qual a avançada tecnologia funcional genômica é usada, ao lado de técnicas nutricionais e bioquímicas, para determinarem os mecanismos pelos quais os alimentos e seus componentes individuais modulam processos que ocorrem nos tecidos do corpo humano”. Instituto de Pesquisa de Alimentos, 2001

9 Abordagem molecular: Estudo entre as interações dos nutrientes com os genes e o efeito na saúde do indivíduo É o estudo entre o relacionamento molecular do nutriente e a resposta do genes. A esperança é fazer uma dieta personalizada com base no genotipo. Nutrientes são sinais que atuam nas celulas. Eles podem ser detectados na celula por sensores biológicos (ex fatores de transcricao). Ai modificam a expressao gene, proteina e metaboloma, de acordo com o local de acao do nutriente. Assim diferentes nutrientes vao ter respostas diferentes na celula. A nutrigenomica quer entender melhor esses processos. O primeiro passo é investigar os genes que sao afetados por nutrientes (transcriptoma). Ai entao deve ser estudado a regulacao do gene. Tambem pode ocorrer diferencas entre o individuos para o mesmo gene! Ou diferencas individuais! Como isso afeta a saúde humana? Permitirá aumentar nossos conhecimentos de como o nutriente modula a expressão de um gene e uma proteína e assim sua influência no metabolismo celular e no organismo. Como a dieta afeta a expressão gênica? Efeito do nutriente no nível molecular do organismo. A nutrigenômica irá aumentar o entendimento da relação dieta-gene-saúde! Estudos epidemiológicos mostram associação entre alimento ingerido Vs incidência de doença crônicas. Alimentos simples possuem uma complexidade de componentes que poderão interagir com o genoma. Os alvos mais importantes da nutrigenomica são: o estudo da influencia da nutricao nos genes, especialmente no inicio de sindromes metabolicas, resistencia a insulina e diabetes. Buscar dietas que prevenem o surgimento de doenças. Do ponto de vista molecular os nutrientes sao moléculas sinalizadoras que podem levar a ativacao de genes resultando em expressao de proteinas. Um desfio na pesquisa nutritional é a complexidade e variedade de nutrientes e alimentos. É um desafio trabalhar com seres humanos organismo complexo, uma sujestão seria utilizar por ex a drosofila, uma mosca ela possui tecidos semelhantes a adipocitos, sendo um modelo interessante para se estudar a obesidade e doencas associadas.

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11 Nutrientes atuam em transdução de sinal
Chá verde Polifenol 11-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) Inibe NF-kappaB fator de transcrição Nutrientes que controlam a expressão gênica. O nutriente é um sinal que vai ser reconhcido pela fator. Transdução de sinal: conversão de um sinal em outro tipo pela célula. São sequencias ordenadas de reações quimicas dentro da celula, que sao levadas por enzimas. Inibição da fosforilação da tirosina no receptor Her-2/neu e receptor do fator de crescimento. Impedir a sinalização da via do NF-KapaB. NF-kapaB é associado a formas malíginas de câncer de mama.

12 Variabilidade genética!
Porque individuais respondem de forma diferenciada a uma dieta especifica? Variabilidade genética! Fatores que alteram o perfil genetico. Diferenças individuais na genética que afetam o metabolismo. Existem milhoes de polimorfismos. Antigamente nao tinha as ferramentas para se estudar os polimorfismos! As mutações por si sos nao sao polimorfismos, mas ajudam a entender. Polimorfismos: 2 ou mais fenotipos que existem numa mesma populacao!

13 Antes Mutações * Durante as cercas de 1016 mitoses possíveis durante uma vida humana, em cada LOCUS podem ocorrer 108 a 1010 mutações Antes Depois Luz ultra-violeta Locus é uma regiao especifica do cromossomo onde ha determinado gene. ??tendo em conta uma taxa de mutações por genes e por divisão celular de 10-6 a 10-8.

14 Mutações Replicação Transcrição RNA: Proteína:
* Alteração permanente e transmissível na seqüência de nucleotídeos em um gene que pode causar a alteração ou a perda da função normal. A T C G T A C G G A T C G G A C G G T A G C C T G C C A T C G T A C G G T A G C C T G C C | | | | | | | | | A T C G T A C G G T A G C A T G C C Replicação A T C G T A C G G T A G C A T G C C Transcrição RNA: U A G C A U G C C U A G C C U G C C Proteína:

15 ... ! Tipos de Mutação Sem Sentido TAC CAC GTG ATA TAC CCC GTG ATT
AUG GUG CAC UAU AUG GGG CAC UAA MET VAL HIS TYR MET GLY HIS STOP ... !

16 Tipos de Mutação Sentido Trocado
TAC CAC GTG CAC TAC CCC GTG CAC AUG GUG CAC GUG AUG GGG CAC GUG MET VAL HIS LEU MET GLY HIS LEU

17 A estrutura da proteína permite que sua função seja executada
A estrutura da proteína permite que sua função seja executada. Alteração em sua estrutura afetará sua especificidade ou atividade. Qual o impacto da mudança dos nucleotídeos? Atrapalha a função da proteína que ela codifica!

18 Modificações das Bases Nitrogenadas
Radiação Ionizante * Formação de dímeros de Pirimidina * Interrupção da replicação * Seqüências truncadas

19 Mutagênicos Químicos * Alguns mutagênicos químicos modificam a estrutura molecular das bases. * No caso dos agentes alquilantes, são adicionados grupos etil ou grupos metil

20 Structures of dietary mutagens
Mutagênicos Químicos Genistein: é uma isoflavona encontrado em plantas como a soja Ochratoxin A: é toxina produzida por fungo aspergilus Benzopyrene: composto organico, fumaça de automóveis principalmente diesel Structures of dietary mutagens Ferguson & Philpott. The annual Review of Nutrition, 28: , 2008.

21 Aflatoxina B1 * Produzida pelo fungo Aspergillus flavus

22 Aflatoxina B1 * Populações expostas a esta molécula tem alto índice de hepatocarcinoma * 50% dos casos de hepatocarcinoma apresentam mutação no gene p53 Transversão É um supressor tumoral Mutações somáticas no gene p53 supressor tumoral são encontradas em aproximadamente 50% dos tumores humanos GC TA

23 Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
Polimorfismo Single Nucleotide Polymorphism (SNP) * Variação em uma seqüência de DNA em um único nucleotídeo * Deve ocorrer em ao menos 1% da população Resultando na alteração do produto gênico. E influenciando a resposta a alimentação. Proteínas com funções alteradas repercurtindo nos processos de digestão, absorção e metabolismo de nutrientes.

24 Como são detectadas as diferenças entre os indivíduos?
O brócolis possui algum efeito na expressão genética na dieta? Experimento por um mês utilizando a Dieta A (enriquecida por Brócolis) e Dieta B (ausência de Brócolis outras hortaliças semelhantes) Sujeitos: gêmeos idênticos saudáveis É uma ferramenta para estudar polimorfismos. Uma forma de se estudar a influencia dos nutrientes no genoma é o estudo do transcriptoma. É o padrão de expressão dos genes. Principal ferramenta para a análise transcriptômica, possibilita analizar simultaneamente 50 mil transcritos. A maioria dos estudos na área da nutrigenômica tem sido focado na análise de RNAm. Baseada na capacidade das moléculas de DNA fita simples de se hibridizarem a sequencias complementares de DNA. Coleta de amostra de tecido! O estudo de muitos genes vai permitir examinar como esse nutriente afeta o genoma.

25 Microarranjo DNA microarray, DNA chip, genome chip, expression chip e gene array São vendidos comercialmente por empresas de biotecnologia Aproximadamente pontos/cm2 Semelhante a uma lamina de vidro de microscópio.

26 DNA Microarray Cada ponto representa um gene distinto
Sequencia de DNA. Constituido de 5 etapas: produção do microarranjo; extração do RNA da amostra biológica; hibridização dos ácidos nucléicos marcados com o microarray; detecção do sinal; análise dos dados. Podem conter moléculas de cDNA ou oligonucleotídeos. No primeiro caso o cDNA é imobilizado em matriz por meio de robôs (lab). No segundo os oligonucleotídeos (20 a 25 bases) são sintetizados no vidro mesmo (fotolitografia) –comercialmente. Cada ponto representa um gene distinto

27 Extração RNA O RNA é separado com auxílio de uma centrífuga , a velocidade alta separa os componentes da solução dependendo do tamanho ou densidade RNA Proteína, DNA e outros componentes Coleta do tecido. Extração do RNA: simplismente dissolvendo o tecido em solventes orgânicos, deixando somente o RNA em solução. O DNA fica em baixo pois ele é muito maior que o RNA. É necessário aproximadamente de 10 a 40 micro gramas de RNA

28 RNA total RNA mensageiro RNA transportador RNA ribossômico

29 Isolamento do mRNA Colunas contendo pequenas esferas recobertas por poli-T que se ligam somente com mRNA que possuem cauda poli-A As outras moléculas serão lavadas para fora Pequenas esferas constituem a coluna Aumento de uma esfera

30 Retenção do mRNA na coluna
As fitas de mRNA ficaram retidas nas esferas poli-T por meio das caudas poli-A

31 Recuperação do mRNA Como liberar o mRNA das esferas?
O pareamento de bases entre moléculas de DNA é comprometido por concentrações de sais e pH A adição de um tampão irá separar o mRNA das esferas poli-T

32 Produção de uma cópia de cDNA fluorescente
Montagem de uma fita complementar de DNA oposta a molécula de mRNA Solução Fluoresncente verde Solução fluorescente vermelha Dieta B Dieta A A mistura marcadora ira montar uma fita complementar de DNA oposta a cada molécula de RNA. O RNA é reversamente transcrito em cDNA, sendo marcado com fluoróforos. São usados 2 fluoróforos (verde e vermelho) permitindo ver 2 amostras distintas. tumorXnão tumor; Célula tratadaXnão tratada. Quando fazemos um cDNA do nosso mRNA nos incorporamos um marcador fluorescente na molécula do cDNA formado. Permitindo a visualização do cDNA

33 Conteúdo da solução fluorescente
Primers Poli-T: unem-se as cadeias poli-A dos mRNA Transcriptase reversa: uma enzima que sintetiza a fita de cDNA Nucleotídeos fluorescentes: serão incorporados na nova molécula de cDNA Transcriptase reversa ou DNA polimerase RNA dependente, realiza o processo de transcrição ao contrário em relação ao padrão celular. Primer são segmentos de ácidos nucleicos com uma sequencia complementar a cadeia poli A

34 Aplicação do cDNAs marcados com fluorescência
Transcriptase reversa produz cDNA fluorescente e moléculas de mRNA foram degradadas com RNAses Tubos contém moléculas de cDNA verde de Dieta A e cDNA vermelho de amostras de células da dieta B. Esse cDNA será aplicado no microarray.

35 cDNAs vermelhos hibridaram com este ponto cDNAs verdes cDNAs que não hibridaram e verdes hibridaram Com este ponto Cerca de 16 a 24 horas de hibridização. O próximo passo é lavar o microarray para retirar os cDNAs que não hibridaram com a placa. A maioria das moléculas de cDNA hibridaram com as fitas de DNA complementar presentes no microarray

36 Leitura da placa de microarray
O scanner lê um fluoróforo por vez; O programa faz uma sobreposição das imagens; O importante são os pontos verdes e vermelhos isolados Um programa de computador possui a lista de genes contidas em cada ponto do microarray A leitura dos pontos é feita de modo separado Resultado: qualquer ponto que possua cDNA verde e vermelho aparece amarelo. Estes pontos não são interessantes pois ambas as amostram possuem esses genes. O leitor contém filtros de emissão e excitação que permite detectar os dois fluoróforos usados. Você é um pesquisador e quer estudar genes que possuem um nível de atividade elevado nos obesos. Qual cor você escolheria? Porque os obesos não posssuem os genes verdes? Pois os genes vermelhos inibem a expressão dos genes verdes

37 Exemplo de aplicação do microarray
Uma linhagem celular de carcinoma de cólon foi tratada com sulforafona Composto bioativo de brócolis Resultado: Indução da expressão do 106 genes Inibição da expressão de 63 genes Atividade anticarcinogênica Composto bioativo do brócolis. Conclusão o brócolis pode reduzir o risco de cancer!! Colon intestino grosso

38 Limitações Necessidade de quantidades significativas de tecido para o isolamento de mRNA. Necessidade de repetições para obter valor significativo Alto custo da técnica O tratamento com nutrientes específicos promovem, geralmente, pequenas alterações na expressão gênica, dificultando a análise dos resultados Baixa reprodutibilidade utilizando-se plataformas de diferentes fabricantes É uma técnica importante porém é uma ferramenta limitada para humanos.

39 Doença inflamatória intestinal (IBD)
Inflamação crônica do trato gastrointestinal Colite ulcerativa (UC) Doença de Crohn (CD) Sintomas: diarréia, cólica abdominal, febre e sangramento Tratamento: remédios que controlam os sintomas, mas não curam a doença; dieta controlada Já vimos exemplos a nivel celular, e nos indivíduos? Como é a acao do nutriente? Taxas de mortalidade são baixas, porém aumento do risco de depressão, indicativo de que a doença é muito desagradável. É considerada uma doença genética. Colite ulcerativa: camadas mais superficiais da mucosa do cólon. Doença de Crohn: afeta predominantemente a parte inferior do intestino delgado e o intestino grosso. A principal diferença entre os tipos da doença é a natureza e localização da doença. Remédios utilizados atuam neutralizando citocinas pro-inflamatórias como TNF-alfa. Alguns indivíduos com SNP (polimorfismo nucleotideo único) não respondem bem aos tratamentos convencionais. Portanto é importante se otimizar o tratamento de acordo com o genótipo do indivíduo. Entretanto a prevenção da doença e controles não farmacêuticos dos sintomas seriam infinitamente melhor. Uma abordagem que reduz os sintomas da doença é remover a dieta normal e providenciar formulas especificas, até que os sintomas sumam. Depois o paciente retorna gradativamente ao alimento sólido. Entretanto a dieta recomendada deve ser individualizada pois existem riscos de benefícios ou deterioração com relação aos alimentos. A otimização da dieta é feita por um processo de eliminação de alimentos, ou seja, removendo todos os alimentos com suspeita. Esse método é laborioso e difícil de seguir na prática, além disso só identifica alimentos que causam reações adversas ao inves de alimentos que contribuam com o controle da doença.

40 Doença inflamatória intestinal (IBD)
Ela surge em parte por uma predisposição genética, herdando-se um número de polimorfismos genéticos. A diferença nesses genes pode levar a uma resposta anormal a simples bacterias residentes lumem intestinal. Neste exemple tem 9 genes distintos. Qual é a dificuldade? Número insuficiente de pacientes com o mesmo fenótipo para identificar características específicas genéticas. Não conseguindo mostrar diferenças significativas. É interessante notar que os genes identificados em diferentes estudos podem ser agrupados em 3 categorias: genes envolvidos no reconhecimento de bacterias, genes que afetam a resposta imunológica e um grupo que afeta o transporte de moléculas na mucosa intestinal. CARD15 relacionado com suscetibilidade a doença de Crohn.

41 Genes envolvidos no estabelecimento da IBD
Reconhecimento de bactérias Na modulação da resposta inflamatória No transporte de moléculas na mucosa intestinal

42 Proteção contra bactérias invasivas
I) Genes envolvidos no reconhecimento de bactérias Proteína NOD2 Observações de diferentes populações demonstrou que o polimorfismo do gene CARD15 ocorre mais vezes em pacientes com IBD quando comparados aos sujeitos não-afetados. CARD15 (Caspase-activation recruitment domain 15). Codifica a proteína NOD2 relacionada com a proteção contra a invasão de bactérias, eliminando patógenos intracelulares. Funciona como um sensor de peptidoglicanos componentes da parede celular de bactérias, nas celulas epiteliais da mucosa gastrointestinal. Proteção contra bactérias invasivas

43 II) Genes envolvidos na modulação da resposta imunológica
Afetam Resposta Imune Relatos inconsistentes dizem que o MHC (major histocompatability complex), que codifica antigenos de leucocitos humanos (HLA). IL23R (receptor de interleucina-23), Região do cromossomo 1p31, Receptor para IL23 uma citocina pró-inflamatória. A IL-23 está relacionada com a resposta inflamatória contra infecções Autoimunidade

44 Transdução de Sinal Intracelular
III) Genes envolvidos no transporte de moléculas na mucosa intestinal Outros genes podem implicar a polaridade da células na mucosa (o gene DLG5). ABCB1 (ATP-binding cassette subfamily B member 1). Codifica uma glicoproteína transportadora dependente de ATP. É altamente expressa na superfície epitelial do intestino onde pode atuar na proteção do epitélio. Transdução de Sinal Intracelular

45 Dieta na doença inflamatória intestinal
A IBD pode ser controlada com uma dieta elemental, que parece modular a ação de citocinas e mudar a microbiota do intestino Desafios: não existe um grupo de alimentos que seja benéficos ou causem danos a todos os pacientes. A dieta de eliminação é usada para se verificar as necessidades individuais Enquanto a farmacologia vem otimizando a terapia dessa doença a nutrigenomica pode tambem auxiliar! A maioria das vezes a IBD pode ser controlada pela dieta: que parece regular a resposta a citocinas e mudar a microbiota intestinal. Atualmente usa-se uma dieta de eliminação para individualizar o tratamento que funciona melhor.

46 Perspectivas IBD Omega-3 pode reduzir os sintomas da inflamação; Chá verde pode regular a expressão de proteínas transportadoras Porém o gene de interesse deve estar funcionando normalmente no paciente A identificação dos genes levam ao desenvolvimento da doença e assim permitir uma abordagem mais específica Dietas específicas poderiam aliviar os sintomas e curar até 90% dos pacientes

47 Concluindo Nutrientes alteram processos moleculares, expressão genética e metabolismo Variações genéticas individuais podem influenciar como os nutrientes são assimilados Ferramentas moleculares estão sendo empregadas para examinar a resposta individual aos nutrientes A nutrigenômica irá desenvolver dietas personalizadas para prevenir o surgimento de doenças e manter a saúde humana Era pós-genoma, surgem diferentes desafios no contexto da pesquisa em nutrição. Vão ajudar a desvendar melhores recomendações dietéticas indivuduais para a redução do risco de doenças crônicas não transmissíveis e a promoção de saúde. Nutrientes desencadeiam efeitos moleculares, benéficos ou não ao organismo dependendo dos genes afetados. Quer entender como a nivel molecular uma dieta alimentar (nutrientes) afeta a saúde por meio da alteração da expressão genética Como ocorre o estabelecimento de uma doenca cronica? Importância dos genes na nutrição: No inicio era fenotipo saudavel, e passou a ser fenotipo de doenca. Isso ocorre quando existe alteração na expressão gênica refletindo na producao de proteinas. Estabelecimento de dietas personalizadas com base no genotipo. Estudos podem ser conduzidos em cultura de células, modelos de experimentação animal, estudos pré-clínicos e clínicos. Desenvolvimento de biomarcadores para verificar o estado de saúde. Identificação de alterações precoces no desenvolvimento de doenças crônicas. Descoberta de nutrientes bioativos benéficos nos alimentos. Desenvolvimento de estratégias para controlar o surgimento de doencas cronicas (Cardiovasculares, Câncer, Diabetes, Outras). Alimentos funcionais = manterão as pessoas saudáveis de acordo com as necessidades individuais. Nutrigenomica é uma ciencia jovem! O estudo da proteomica e metabolomica ainda tem que ser desenvolvido.

48 OBRIGADA PELA ATENÇÃO