Determinação da Estrutura tri-dimensional de Proteínas utilizando

Apresentação em tema: "Determinação da Estrutura tri-dimensional de Proteínas utilizando"— Transcrição da apresentação:

1 Determinação da Estrutura tri-dimensional de Proteínas utilizando
CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS Determinação da Estrutura tri-dimensional de Proteínas utilizando difração de Raios-X

2 CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS
O processo completo consiste em produzir cristais de proteínas (>0.1 mm na sua menor dimensão), nos quais as moléculas estejam razoavelmente bem ordenadas para que o feixe de raios-X incidente sobre esse cristal seja difratado gerando um padrão de reflexões que, através da análise dos dados cristalográficos, produzam um mapa tri-dimensional de densidade eletrônica da molécula. Um modelo da proteína com sequência conhecida deve então ser modelado neste mapa.

3 POR QUE RAIOS-X ? Adaptado de O uso de radiação eletromagnética para visualizar objetos requer que a radiação tenha um comprimento de onda comparável às menores características que desejamos resolver. Os raios-X tem um comprimento de onda de 1.54Å. Este valor é próximo à distância entre átomos de carbono numa ligação peptídica, sendo então ideal para estudar estruturas de proteínas.

4 O cristal atua como um amplificador.
POR QUE CRISTAIS? Incidir Raios-X sobre uma única molécula resultaria num sinal extremamente fraco que nunca poderia ser detectado acima do nível de barulho, gerado pelo espalhamento da água e do ar. Um cristal arranja um número grande de moléculas na mesma orientação, então as ondas espalhadas podem ser adicionadas em fase aumentando o sinal a um nível que possa ser medido. O cristal atua como um amplificador.

5 Método de difusão de vapor com a gota sentada
gota contendo proteína e precipitante Uma gota é formada misturando-se volumes iguais de solução de proteína e de uma solução precipitante. Inicialmente a concentração de precipitante na gota é metade da sua concentração no poço. Um volume bem maior de precipitante é colocado em um reservatório abaixo da gota.

6 Exemplos de cristais de proteínas já estudados
Proteína que liga quitina Tjaard Pijning RU Groninger Biliverdina-IX redustase complexada com NADP Rosa Perez-Luque IBMB-CSIC Barcelona Dihidrolipoamida desidrogenase Tassie & Roeber NASA TIM Aparício LNLS GP120 - uma glicoproteína do envelope exterior do vírus HIVtipo 1 Universidade de Columbia Lisozima Eddie Snell NASA

7 Raios-X e Cristais de Proteínas
Uma vez obtido, o cristal da proteína é irradiado com Raios-X O Experimento : Os raios-X são difratados pelo cristal Espelhos para focalizar o feixe de raios-x Placa de Imagem

8 Padrão de Difração de Raios-X
O espalhamento do feixe de raios-X pelo cristal produz o padrão de difração; A organização dos pontos no padrão está relacionada com a distribuição de moléculas no cristal; Diferenças de intensidade relacionam-se com a distribuição dos átomos na molécula.

9 Mapa de densidade eletrônica
O resultado do experimento não é a figura dos átomos , mas um mapa de distribuição dos elétrons na molécula, isto é, um mapa de densidade eletrônica. No entanto, uma vez que os elétrons são mais localizados ao redor do núcleo, o mapa de densidade eletrônica nos dá uma boa idéia da molécula.

10 A resolução é medida em Ångstroms (Å).
Está diretamente relacionada com a distância mínima a que dois objetos podem estar e ainda serem vistos como dois objetos. Todos os modelos tem uma incerteza na posição dos átomos. Valores numéricos pequenos para resolução significam uma pequena incerteza, então resolução alta; valores altos significam uma grande incerteza, então resolução baixa. A resolução é medida em Ångstroms (Å). Quebra na densidade eletrônica Posição do CO não está bem definida 7.0 Å é uma resolução baixa para proteína 3.0 Å é uma resolução média 1.6 Å é alta resolução

11 Ajustando o modelo na densidade eletrônica
Mapa de densidade eletrônica Átomos são inseridos na densidade para construir o modelo da proteína

12 Construção do modelo da proteína
Uma vez obtido o mapa de densidade eletrônica, é necessário colocar a sequência de aminoácidos da proteína dentro da densidade para construir o modelo:

13 Análise do modelo para estudo da função da proteína
Uma vez obtida a estrutura tri-dimensional da proteína podemos utilizá-la para: entender seu funcionamento...

14 … visualizar partes específicas de uma proteína como sítios de ligação de pequenas moléculas, para entender como a ligação acontece...

15 … verificar as distâncias interatômicas...

16 … fazer comparações entre estruturas de proteínas, ...

17 … visualizar a distribuição de cargas na superfície da proteína, etc.
Azul: cargas positivas Vermelho: cargas negativas

18 A informação estrutural é essencial para entender como as moléculas biológicas funcionam e fornece conhecimento para a obtenção de novos medicamentos para cura de doenças como AIDS, Câncer, anemia, diabetes, etc. HIV protease ligado a um inibidor