CINÉTICA ENZIMÁTICA Diagrama mostrando a Anidrase carbónica II. A esfera a cinzento é um ion de zinco que funciona como cofator no sítio ativo.

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1 CINÉTICA ENZIMÁTICA Diagrama mostrando a Anidrase carbónica II. A esfera a cinzento é um ion de zinco que funciona como cofator no sítio ativo.

2 CINÉTICA ENZIMÁTICA

3 CINÉTICA ENZIMÁTICA

4 CINÉTICA ENZIMÁTICA A linha em vermelho representa a reação na ausência de catalisador; A linha em azul na presença de enzima. S: nível de energia do(s) substrato(s); P: nível de energia do(s) produto(s); G: energia de Gibbs; R: coordenada de reacção (sentidos de progressão de reacção); ΔG'º: energia livre padrão bioquímica; ΔG‡: energia de ativação S-P: do(s) substrato(s); P-S: do(s) produto(s)).

5 A cinética enzimática é o estudo do mecanismo pelo qual as enzimas ligam substratos e os transformam em produtos. São utilizados dados sobre a velocidade de reação de enzimas através de ensaios enzimáticos. Mecanismo de reação de uma enzima com substrato único. A enzima (E) liga o substrato (S) e liberta o produto (P).

6 Cinética de Michaelis–Menten
Curva de saturação para uma enzima mostrando a relação entre a concentração do substrato e a velocidade de reação; As reações catalisadas por enzimas são saturáveis, e a sua velocidade de catálise não indica uma resposta linear face ao aumento de substrato. Se a velocidade inicial da reação é medida sobre uma escala de concentrações de substrato [S]); a velocidade de reação (v), aumenta com o acréscimo de [S]. A medida que [S] aumenta, a enzima satura-se e a velocidade atinge o valor máximo Vmax.

7 CINÉTICA ENZIMÁTICA A saturação acontece porque, à medida que é aumentada a concentração de substrato, aumenta também a quantidade de enzima presente sob a forma de complexo enzima-substrato (ES). À velocidade máxima, Vmax, todos os centros ativos estão ocupados (saturados) com substrato, ou seja, não existe enzima livre para ligar mais substrato e a concentração de complexo ES é igual à concentração de enzima.

8 CINÉTICA ENZIMÁTICA A atividade de uma enzima é geralmente descrita através de Vmax e também da constante de Michaelis-Menten (KM), que representa a concentração de substrato à qual se detecta uma velocidade de reacção igual a metade de Vmax; Cada enzima possui um KM característico (kcat) para um dado substrato; este parâmetro é muitas vezes usado para demonstrar a força de ligação de um substrato à enzima. É também usada outra constante cinética, kcat, para descrever o comportamento de uma enzima, representando o número de moléculas de substrato que podem ser catalisadas por centro ativo por segundo.

9 No modelo da cinética de Michaelis-Menten de uma reação com um substrato existe uma reação bimolecular inicial entre a enzima E e o substrato S para formar o complexo ES. Embora o mecanismo enzimático para a reação unimolecular                              possa ser bastante complexo, há tipicamente um passo na determinação da velocidade que permite que se modele o mecanismo como um passo catalítico simples de velocidade constante k2.             (Eq. 1). k2 também é o valor máximo de reações enzimáticas catalisadas por segundo.

10 Com baixas concentrações de substrato [S], a enzima permanece em equilíbrio entre a forma livre E e o complexo enzima-substrato ES; aumentando [S] aumenta [ES] à custa de [E], mudando o equilíbrio para o lado direito. Uma vez que a velocidade de reação depende da concentração [ES], a velocidade é sensível a pequenas alterações de [S]; Altos valores de [S], a enzima fica totalmente saturada com substrato, e existe apenas na forma ES. Nestas condições, a velocidade (v≈k2[E]tot=Vmax) é insensível a pequenas alterações de [S]; assim, [E]tot é a concentração total enzimática que é aproximadamente igual à concentração [ES] em condições de saturação.

11 A equação de Michaelis–Menten[7] descreve como a velocidade de reação v depende da posição do equilíbrio ligado ao substrato e da constante de velocidade k2. Michaelis e Menten mostraram que se k2 for bem menor que k-1 (chamada a aproximação de equilíbrio), pode obter-se a seguinte equação: A constante de Michaelis Km é definida como a concentração para a qual a velocidade da reacção enzimática é metade de Vmax. Isto pode verificar-se ao substituir Km = [S] na equação de Michaelis-Menten. Se o passo para determinação da velocidade for lento, quando comparado com a dissociação do substrato (k2 << k-1), então a constante de Michaelis Km é aproximadamente à constante de dissociação do complexo ES, embora tal situação seja relativamente rara.

12 A situação mais normal dá-se quando k2 > k-1 na por vezes chamada cinética de Briggs-Haldane. A equação ainda se verifica em condições mais gerais, como provém da aproximação ao estado estacionário. Durante o período inicial, a velocidade de reação v é relativamente constante, indicando que [ES] é também aproximadamente constante (cf. equação 1): A concentração de [ES] é dada por: em que a constante de Michaelis Km é definida por:

13 ([E] é a concentração de enzima livre);
. Em conjunto, a fórmula geral para a velocidade de reação v vem pela equação de Michaelis-Menten: A constante de especificidade kcat / Km é uma medida da eficiência de conversão pela enzima do substrato em produto. Usando a definição da constante de Michaelis Km, a equação escreve-se na forma:

14 O gráfico de velocidade face a [S] não é linear.
Embora a baixas concentrações de substrato se mantenha linear, vai curvando à medida que aumenta a concentração de substrato. Antes da chegada dos computadores, que permitem ajustar regressões não lineares de forma simples, podia chegar a ser realmente difícil estimar os valores de Km e Vmax nos gráficos não lineares. Então vários pesquisadores concentrassem os seus esforços em desenvolver métodos de linearização da equação de Michaelis-Menten, dando como resultado o gráfico de Lineweaver-Burke

15 O gráfico de Lineweaver-Burk ou representação de duplo recíproco é a forma mais comum, e simples,de mostrar os dados da cinética enzimática. Para tal, tomam-se os valores inversos de ambos os lados da equação de Michaelis-Menten. Como se pode apreciar na figura da direita, o resultado deste tipo de representação é uma linha reta cuja equação é e = mx + c, sendo o ponto de intercecção entre a reta e o eixo das ordenadas equivalente a 1/Vmax, e o ponto de intercepção entre a recta e o eixo de abcissas equivalente a -1/Km. O gráfico de Lineweaver-Burke ou do duplo recíproco mostra o significado dos pontos de intercecção entre a reta e os eixos de ordenadas, e do gradiente da velocidade.

16 INIBIÇÃO ENZIMÁTICA Esquema cinético para inibidores enzimáticos reversíveis. E=Enzima; S=Substrato; ES=Complexo; P=Produto; I=Inibidor

17 INIBIÇÃO ENZIMÁTICA Inibidores enzimáticos são moléculas que reduzem ou eliminam a atividade das enzimas. Podem encontrar-se dois tipos: Reversíveis: quando a remoção do inibidor restaura a atividade enzimática; classificados como competitivos, acompetitivos, não-competitivos e mistos, segundo o efeito que produzam nas constantes cinéticas Km e Vmax. Este efeito dependerá da união do inibidor à enzima E, ao complexo enzima-substrato ES ou a ambos. Irreversíveis: quando o inibitor inativa de modo permanente a enzima. Geralmente produzem modificações covalentes de resíduos do centro catalítico da enzima. Estas reacções decaem de forma exponencial e são habitualmente saturáveis. Abaixo dos níveis de saturação, mantêm uma cinética de primeira ordem em relação ao inibidor.