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PublicouJonatas Formosa Alterado mais de 10 anos atrás
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BCM13042 Fundamentos de Análises de Proteínas
Docentes Célia R Carlini Charley C. Staats Diogo R Demartini Hugo Verli Súmula Aminoácidos e peptídeos: estrutura; estereoquímica; propriedades físico-químicas; curva de titulação; ponto isoelétrico; ligação peptídica Proteínas: arquitetura de proteínas; tipos de estrutura secundária; enovelamento; modificações pós-traducionais; mobilidade eletroforética; flexibilidade; catálise Métodos para determinação da estrutura de proteínas: RMN; cristalografia de raios-X; Dicroísmo circular Espectometria de massas: metodologias de ionização; metodologias de análise. Métodos para determinação da quantidade de proteínas: gravimétrico; absorbância; fluorescência; ninhidrina; biureto; lowry; azul de comassie; acido bicinchônico. Métodos de separação, purificação se sequenciamento de proteínas, peptídeos e aminoácidos: precipitação; salting in; salting out; eletroforese; cromatografia liquida, ultracentrifugação; química de Edman; métodos de separação de aminoácidos.
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BCM13042 Fundamentos de Análises de Proteínas
22/11 Aminoácidos e peptídeos: Charley 23/11 Estrutura e determinação da estrutura de proteínas: Hugo 24/11 Métodos de quantificação, análise e purificação de proteínas: Célia 25/11 Espectrometria de massas e proteômica 29/11 – 02/12 Seminários 1 tópico por dia 5 grupos por tópico
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Tópico 1 – Métodos de Análise e Caracterização de Peptídeos
Papéis Biológicos de D-Aminoácidos Determinação de sequencia de aminoácidos/peptídeos (Edman, MS-MS, Dansylação) Assinalamento de padrões (bioinformática) Modificações pós-traducionais: tipos, funções e impactos em análises Síntese de peptídeos para avaliação biológica Tópico 2 – Métodos de Análise e Caracterização de Peptídeos Eletroforeses (1D, 2D, nativa, zimogramas) Cromatografia (troca iônica, hidrofóbica, fase reversa, afinidade) Metodologias de quantificação de proteínas Precipitação fracionada Métodos Imunoquímicos Tópico 3 – Espectrometria de massas e proteômica MudPit / GELC – MS Proteômica quantitativa comparativa Metaloproteômica Fosfoproteômica Interatoma Tópico 4 – Determinação de estrutura RMN Dicroísmo circular Fluorometria Cristalografia – Raios X Determinação de motivos estruturais
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BCM13042 Fundamentos de Análises de Proteínas
Avaliação Apresentação de 1 item referente a cada tópico Respostas aos questionários aplicados pelos colegas Cada aluno deverá formular 1 questão sobre o item apresentado Os demais alunos deverão escolher 2 questões referentes a cada tópico para responder As questões devem ser embasadas em um artigo científico. Espera-se que a questão seja formulada a partir de um gráfico ou tabela presente no artigo científico. O autor da questão será responsável pela correção. Aulas serão disponibilizadas junto ao endereço
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Sorteio
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Amino-Ácidos
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Estrutura geral dos Aminoácidos
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Quantos aminoácidos existem em sistemas biológicos?
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20 aminoácidos definidos por seu códon no mRNA Grupo R 5 grupos distintos 2 aminoácidos não usuais Inserção depende de um elemento cis no mRNA
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Polar - aquoso Apolar - lipídico Polar - aquoso
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Selenocystein Pyrrolysine
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Hypothetical scheme for the cotranslational insertion of pyrrolysine in response to a context-dependent UAG codon. Hypothetical scheme for the cotranslational insertion of pyrrolysine in response to a context-dependent UAG codon. tRNAPyl (anticodon CUA) is either first aminoacylated with lysine, and subsequently modified to generate Pyl-tRNAPyl, or alternatively Pyl-tRNAPyl is directly synthesized by an unknown route. Pyl-tRNAPyl would then bind the SelB-like elongation factor EF-Pyl (see text for details of candidate EF-Pyl proteins). The Pyl-tRNAPyl:EF-Pyl complex would associate with the pyrrolysine insertion sequence (PYLIS) via a putative PYLIS binding protein (PBP), thereby directing delivery of Pyl-tRNAPyl to the ribosomal A site when the decoding site is occupied by the corresponding UAG. Ibba M , Söll D Genes Dev. 2004;18: ©2004 by Cold Spring Harbor Laboratory Press
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Formação de pontes de enxofre
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Estereoisomeros a-carbon is a chiral center
Two stereoisomers are called enantiomers. The solid wedge-shaped bonds project out of the plane of paper, the dashed bonds behind it. The horizontal bonds project out of the plane of paper, the vertical bonds behind.
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The Stereochemistry of Amino Acids
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D-aminoácidos existem e são metabolizados
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Serine-racemase
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D-amino ácidos em proteínas?
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Características físico-químicas dos aminoácidos
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Absorbância na região UV de aminoácidos aromáticos
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Estudos conformacionais – Try fluorescence
Changes in low density lipoprotein receptor intrinsic tryptophan fluorescence upon calcium addition. Changes in intrinsic tryptophan fluorescence upon calcium addition. The fluorescence emission of tryptophan residues in LDL-R354 was measured from 300 to 400 nm at 1-nm increments after excitation at 280 nm. Fluorescence intensity measurements are expressed in arbitrary units as the ratio of channel A (sample channel) to channel B (reference channel). Each sample contained 7.4 μg of protein in 10 mm Tris, 60 mm KCl, pH 7.4. (Squares, 100 μm free Ca2+; circles, 100 μm EDTA; closed symbols, 7.4 μg LDL-R354; open symbols, buffer alone [no protein]). Dirlam-Schatz K A , Attie A D J. Lipid Res. 1998;39: ©1998 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology
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Zwitterion = íon híbrido
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Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc.
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Efeito sobre o pKa do ambiente químico
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Henderson/Hasselbach equation and pKa
Protonated form Unprotonated form (conjugate base) HA ↔ H+ + A- Ka = [H+] [A-] / [HA] [H+] = Ka [HA]/ [A-] -log [H+] = -log (Ka [HA]/ [A-]) -log [H+] = -log Ka -log ([HA]/ [A-]) pH = p Ka - log ([HA]/ [A-])
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Titulação de um aminoácido
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Curva de titulação Glutamato
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Curva de titulação> Histidina
Anel indólico
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Peptídeos
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Formação da ligação peptídica
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Níveis estruturais das proteínas
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Como se definem estruturas secundárias?
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Distâncias interatômicas na ligação peptídicas são menores que as de uma ligação amida comum
Ressonância eletrônica Ligação peptídica tem 50% de carácter de dupla ligação rígida e coplanar
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Ângulos de rotação da cadeia polipeptítica em torno de um carbono alfa
Cadeias laterais
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A B C D E F Gráfico de Ramachandran
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O que é um domínio protéico?
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Procura de domínios conservados
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Localização da proteína pode trazer informações sobre a sua função
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