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Miguel Galves Orientador: Zanoni Dias IC - UNICAMP 01/12/2006
Uma abordagem computacional para a determinação de polimorfismos de base única Miguel Galves Orientador: Zanoni Dias IC - UNICAMP 01/12/2006
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Roteiro Conceitos Básicos Motivação Objetivos
Alinhamento de seqüências Detecção de SNPs e confiabilidade Correlação de SNPs Conclusão
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Processo básico de tradução genética
A informação genética dos seres vivos é armazenada em cadeias de nucleotídeos Bases A, C, G e T Proteínas são geradas a partir da leitura da cadeia de nucleotídeos Processo de tradução Proteína = cadeia de aminoácidos 1 aminoácido = 3 nucleotídeos = 1 códon
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Tradução Interessante: 64 codons, apenas 20 aminoacidos.
1 aminoacido pode ser codificado por varios codons.
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Polimorfismos e SNP Polimorfismo: dois ou mais alelos diferentes em indivíduos da mesma espécie Deve aparecer em pelo menos 1% da população SNP: polimorfismo que ocorre em apenas uma base da seqüência SNP sinônimo: não modifica o aminoácido SNP não sinônimo: modifica o aminoácido
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Porque estudar SNPs? Criação de terapias específicas
Correspondem a mais de 90% dos polimorfismos nos seres humanos Causa de grande parte das doenças com base genética Grande interesse das industrias farmacêuticas Criação de terapias específicas Marcadores para mapeamento fino do genoma
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Objetivos do trabalho Estudar 3 etapas distintas no processo de detecção e análise de SNPs: Alinhamento de ESTs com DNA genômico Detecção de SNPs por análise de cromatograma Correlação de SNPs Etapas distintas: problemas, conjuntos de dados e conclusoes
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Alinhamento de DNA com ESTs
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Alinhamento de sequências
Inserção de espaços em duas seqüências de forma a que elas tenham o mesmo tamanho e possam ser comparadas Exemplo: AGCTCGTTTG e ACCTTCGTTTTG AGC-TCGTTT-G ACCTTCGTTTTG Pontuação permite avaliar o alinhamento Problema de otimização: obter o alinhamento de melhor pontuação
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Algoritmos clássicos de alinhamento
Estratégias de alinhamento Global Semi-global Local Sistemas de pontuação Simples: match, mismatch, gap Linear: match, mismatch e gap(k) = g + hk
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Porque estudar alinhamento de mRNA com DNA?
Começar falando de exons e introns no DNA Falar do processo de de transcriçao nos eucariotos Caracterizacao de mRNA Falar dos pacotes computacionais que utilizam varias euristicas
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Objetivos desta etapa Determinar uma estratégia clássica e um conjunto de parâmetros que permitam obter bons alinhamentos entre DNA genômico e mRNA
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Metodologia Desenvolvimento de um alinhador em Java usando algoritmo de Miller e Myers Criação de uma base de testes Definição de um conjunto de parâmetros de alinhamento Execução de alinhamentos de mRNAs com genes de origem Nosso alinhador, sim4, est_genome e Spidey Definição de métricas para avaliação dos alinhamentos obtidos
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Conjunto de dados 64 genes do cromossomo Y humano com menos de bases 40 genes completos do cromossomo Y humano com menos de bases 7376 genes completos do genoma humano com menos de bases 4930 ESTs artificiais do cromossomo 6 com erros aleatórios de 1% a 10%
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Resultados obtidos - Conjunto 3
Extra Gap Delta Exon Similaridade Mismatch (1,-2,-1,0) 0.00 99.89% 0.00% (1,-2,-10,0) 0.01 Sim4 1.03 -0.03 99.18% 0.21% Est_genome 15.56 -0.17 58.00% 1.31% Spidey 0.12 -3.82 81.02% 0.17%
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Resultados obtidos - Conjunto 4
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Resultados obtidos - Conjunto 4
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Resultados obtidos O alinhador semi-global com esquemas de pontuação (1,-2,-1,0) e (1,-2,-10,0) produzem resultados extremamente satisfatórios O esquema (1,-2,-10,0) tende a gerar blocos de introns maiores Sim4, est_genome e Spidey são mais regulares com ESTs com erros
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Detecção de SNPs
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Base-calling e sequenciamento
Eletroforese: quanto mais pra baixo, mais pro inicio da sequencia Pacotes como phred e AB1 leem o cromatograma e determinam as bases
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Porque estudar base-calling?
Pacote phred ignora sinais secundários no cromatograma Apenas uma base por posição SNPs podem gerar sinais secundários PolyBayes e PolyPhred não produzem resultados satisfatórios com HIV
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Objetivos desta etapa Detecção de SNPs em cromatogramas de seqüências de HIV Estudo de métodos para determinação de confiabilidade dos resultados
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Metodologia Definir algoritmos para análise e correção de cromatograma
Executar os algoritmos com diversos parâmetros, para análise preliminar Determinação de dois algoritmos para tunning Determinação do melhor algoritmo e do melhor conjunto de parâmetros
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Conjunto de dados Sequências genéticas de HIV
1302 bp Região bem conservada 35 lotes de amostras de indivíduos soropositivos 6 leituras 1 seqüência validada, com SNPs anotados manualmente Sequência de referência de HIV 6 leituras = resultado de protocolo experimental para identificacao de HIV Leituras de baixa qualidade
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Algoritmos de correção
Relação das Áreas Relação das Médias das Alturas Limite Variável Pico Único por Janela Eliminação de Picos Ruins Pico Mais Baixo
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Relação das Áreas
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Relação das Médias das Alturas
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Resultados obtidos Verdadeiro Positivo Falso Negativo Falso Positivo
Área 75% 23% 394% Média das alturas 53% 42% 317% PolyPhred 0% 100% PolyBayes
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Confiabilidade Estatística
Comparação de dois métodos de confiablidade estatística para SNPs: PolyBayes: estatística bayesiana MSASNP: qualidades das bases Conjunto de teste: SNPs anotados do SUCEST MSASNP gera muitos falsos positivos e acerta menos posições que o PolyBayes
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Correlação de SNPs
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Linkage Disequilibrium
Associação não aleatória entre alelos Informações sobre um alelo fornece informações sobre o outro Medidas para quantificar LDs D’ = 1, chamado de LD completo r2 1/3, chamado de LD útil LD múltiplo: conjunto de SNPs em LD dois a dois
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Porque estudar LDs? Doenças genéticas podem ser influenciadas por vários SNPs correlacionados LD permite efetuar mapeamento fino do genoma humano Técnica tradicional: definição de 1 a 2cM LD: definição de 0.1cM 1 cM = 1Mbp 0.1 cM = 100kbps
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Objetivos desta etapa Estudar LDs múltiplos
Analisar o efeito do uso das medidas D’ e r2
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Metodologia Pré-processamento do conjunto de dados
Definição de uma heurística para busca de cliques em grafos Problema NP-Difícil Executar a busca por LDs múltiplos nos dados utilizando medidas D’ e r2
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LDs múltiplos
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LDs múltiplos (j, f, i, e, g, m, n) (k, l, h)
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Conjunto de dados ESTs clusterizados de cana-de-açúcar do projeto SUCEST, com SNPs anotados Genes do genoma humano obtidos do NCBI: HLA-A, HLA-B e HLA-DOB Genes do complexo MHC Região com alta densidade de SNPs anotados MHC : Major Histocompatibility Complex Funções imunologicas
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Resultados Bons resultados obtidos com tempo de busca de 5 segundos por clique D’ apresenta resultados melhores Maior capacidade de agrupamento Menor tendência de isolamento de SNPs r2 gera grafos com menos arestas
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Considerações finais Foram estudadas 3 etapas distintas relacionadas a SNPs Resultados bastante satisfatórios, tendo em vista o tipo de problema analisado Seria interessante implementar um fluxo de trabalho único unindo estas etapas
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Trabalhos publicados Alinhamento Detecção de SNPs
M. Galves e Z. Dias, "Comparison of genomic DNA to cDNA alignment methods“. Lecture Notes on Bioinformatics, Springer-Verlag Berlin Heildelberg. Apresentado no BSB 2005, Porto Alegre - RS. Detecção de SNPs M. Galves, J. A. A. Quitzau e Z. Dias, "New strategy to detect single nucleotide polymorphisms", Genetics and Molecular Research, Apresentado no X-Meeting 2005, Caxambu - MG.
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Relatórios técnicos LDs múltiplos Confiabilidade Estatística
A. A. M. Almeida, M. Galves e Z. Dias, “Um algoritmo para identificação de correlações múltiplas de polimorfismos” (IC-06-14), Setembro 2006. Confiabilidade Estatística C. Baudet, M. Galves e Z. Dias,“Comparação de métodos para determinação de SNPs com medidas de confiabilidade” (IC-06-15), Setembro 2006.
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