TRANSCRIÇÃO Como o DNA Vira RNAm?.

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1 TRANSCRIÇÃO Como o DNA Vira RNAm?

2 ≠ DNA e RNA DNA = Ácido Desoxirribonucleico Molécula Dupla fita
Pentose: desoxirribose Bases Nitrogenadas: Citosina, Guanina, Adenina e Timina Encontrado somente no núcleo; Função: Armazenamento O DNA replica e é transcrito em um RNAm; Mesma quantidade encontrada em todas as células nucleadas. RNA = Ácido Ribonucleico Molécula Simples Fita Pentose: Ribose Bases Nitrogenadas: Citosina, Guanina, Adenina e Uracila. Função: Transmissão da informação, Catálise (Ribozimas) e Estrutural (RNAt, RNAr) Formado no núcleo mais migra para o citoplasma para ser traduzido numa proteína; Varia de célula para célula conforme a taxa da expressão gênica, que se transformará em RNAm

3 Principais Diferenças entre Replicação (DNA) e Transcrição (RNAm)
Duas fitas são utilizadas como molde; Semiconservativa; Fitas de DNA antiparalelas; Origem de Replicação; O sentido da transcrição 5´→ 3´ Na fita descontínua ocorre a ligação de um iniciador e a formação dos fragmentos de Okasaki; Principal enzima DNA polimerase Ocorre somente no núcleo das células satélites, para reparar as fibras lesionadas; qdo estas foram submetidas a algum tipo de injúria.

4 Enquanto na Transcrição
Transcrição (RNAm) Apenas uma das fitas é utilizada como molde; Apenas uma fita de DNA é transcrita em RNAm; As sequencias de DNA transcritas, são as sequencias gênicas; Não precisa de um iniciador para começar a transcrição; Inicia no núcleo das células satélites e no núcleo das células musculares esqueléticas e termina nos citoplasmas destas. Principal enzima RNA polimerase A transcrição de RNAm no músculo é aumentada, ou regulada por estímulos fisiológicos e ambientais.

5 Principais Similaridades entre Replicação (DNA) e Transcrição (RNAm)
Ambas possuem 3 etapas: Iniciação Alongamento Terminação RNA polimerase adiciona os Ribonucleotídeos (A, G, U, C) Na extremidade 3´ Aumentando a fita de RNAm

6 #comovistoanteriormente
#tátudobematéaqui? #algumadúvida? #diferençaentrereplicaçãoetranscrição? #posso continuar? #comovistoanteriormente

7 A célula Eucariótica Sendo que?
É a unidade morfofuncional de todos os organismos vivos Eucarióticos. Está dividida em: Membrana; Organelas Citoplasma: RNAm Núcleo: DNA enrolado em histonas formando os cromossomos. Na espécie humana Temos 22 pares de cromossomos 1 par de cromossomos sexuais Homem – XY Mulher - XX Sendo que?

8 Sendo que cada região gênica…
Cada cromossomo GENE 1 GENE 2 GENE 3 GENE 4 Sendo que cada região gênica… Não gênicas Não gênicas Não gênicas

9 É formada Sequencias regulatórias que se localizam antes dos genes, e onde os fatores de transcrição se ligam. Uma região promotora reconhecida pela RNA polimerase e onde inicia a transcrição. A região de TRANSCRIÇÃO GÊNICA formada por éxons (regiões Codificantes, que originarão o RNAm que será traduzido em uma proteína); íntrons (regiões não Codificantes, que serão removidas, pelo mecanismo de Splicing do transcrito primário) Região onde a cauda poliA será adicionada

10 Existem genes que são expressos
Constitutivamente (Genes housekeeping) Regulados Expressos em todos os tecidos; Expressam proteínas essenciais para a manutenção da vida, normalmente envolvidos em processos básicos como: Geração de Energia Replicação Manutenção do Material Genético Exemplos: β-actina; GAPDH Genes expressos em alguns tecidos, cuja função está diretamente relacionada à função do órgão/tecido; Ex: Genes expressos no músculo esquelético; Genes expressos em somente um tecido, de função altamente especializada. β-globina expressa somente nos eritrócitos Genes expressos em somente uma célula, e todas as células clonais descendentes desta progenitora. Ex: Genes expressos na célula satélite para diferenciação celular em mioblasto após o trauma por estresse.

11 #tátudobematéaqui? #algumadúvida?

12 Além disso, grupos gênicos codificarão
Sequências que originarão RNAm (constitutivos, regulados) que originarão uma proteína GENE 1 GENE 2 GENE 3 GENE 4 Não gênicas Sequências que originarão RNA (constitutivos) com uma função catalítica RNAinterferente, snRNA Não gênicas Não gênicas

13 O que precisamos para que a transcrição ocorra?
A transcrição de cada gene é cuidadosamente regulada Para formar produtos gênicos apenas na proporção Necessária A regulação pode ocorrer em qualquer etapa da transcrição Grande parte da regulação direciona as etapas de ligação da RNA polimerase, no início da transcrição E quem faz esta regulação são os FATORES DE TRANSCRIÇÃO SELETIVOS Ex: Dedos de Zinco (Zinc Fingers) Zíperes de Leucina

14 #tátudobematéaqui? #algumadúvida?

15 Como ocorre a transcrição?

16 Para que a transcrição ocorra na Etapa de Iniciação
Ocorre a ligação dos Fatores Proteicos de Transcrição (TF), na região TATA box, o primeiro (TF) a se ligar é o TFIID. Em seguida, ligam-se os fatores TFIIA, TFIIB, permitindo que a RNApolimeraseII (RNApol II) se ligue, Logo após os TFIIF, TFIIE, TFIIH se ligam e libera a RNApol II, Mas para que a RNApol II transcreva tem que ocorrer a fosforilação de algumas proteínas, após esta fosforilação a RNA, RNApol II, desenrola a Dupla Fita de DNA e a transcrição vai para a fase de Alongação.

17 Etapa de Iniciação da Transcrição

18 ALONGAMENTO

19 Nesta Etapa ocorre também a adição 7-metil guanosina na extremidade 5´ (Cap-5´)
Após a adição de 30 nucleotídeos no RNA primário ocorre a adição da 7-metil guanosina (7-Mg) na posição 5´. O revestimento de 7-MG contém uma ligação incomum 5’-5’ trifosfato e mais alguns grupos metila. Os 7-MG são reconhecidos por fatores envolvidos no início da tradução a protege as cadeias nascentes de RNA da degradação por endonucleases.

20 TÉRMINO

21 Término Ocorre a clivagem do RNA primário numa região específica;
Em seguida uma enzima adiciona a cauda poliA (cerca de 150 a 250 nucleotídeos de Adenina); Formação do RNA primário que ainda contém todos os éxons e íntrons;

22 CabÔ?????

23 Como o RNAm é produzido? ATÉ AGORA EU SÓ PRODUZI O RNA PRIMÁRIO.
MAS EU PRECISO DO RNA MENSAGEIRO, AQUELE QUE CARREGA A MENSAGEM, RNAm, ATÉ O RIBOSSOMO PARA SER TRADUZIDO EM PROTEÍNA. Como o RNAm é produzido?

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33 Luciana Maria de Hollanda
RNA de interferência Luciana Maria de Hollanda

34 Foi precedida pelo estudo Com plantas transgênicas em 1990 EUA Holanda
A descoberta do RNAi... Foi precedida pelo estudo Com plantas transgênicas em 1990 EUA Holanda Chalcona sintase The discovery of RNAi was preceded first by observations of transcriptional inhibition by antisense RNA expressed in transgenic plants,[141] and more directly by reports of unexpected outcomes in experiments performed by plant scientists in the United States and the Netherlands in the early 1990s.[142]  In an attempt to alter flower colors in petunias, researchers introduced additional copies of a gene encoding chalcone synthase, a key enzyme for flower pigmentation into petunia plants of normally pink or violet flower color.

35 Os cientistas esperavam que...
Com a hiperexpressão Do gene a planta produziria Maior pigmentação Tornando-se mais coradas Só que ao invés disso... ...ocorreu a diminuição da expressão da chalcona sintase e tanto os genes inseridos quando os genes endógenos foram hipoexpressos The overexpressed gene was expected to result in darker flowers, but instead produced less pigmented, fully or partially white flowers, indicating that the activity of chalcone synthase had been substantially decreased; in fact, both the endogenous genes and the transgenes were downregulated in the white flowers. Soon after, a related event termed quelling was noted in the fungus Neurospora crassa,[143] although it was not immediately recognized as related.

36 Investigações Futuras em Plantas
Indicaram que A diminuição da regulação Era devida a Inibição Pós-Transcricional Diminuindo a taxa do RNAm Degradando completamente este RNAm Cossupressão da expressão gênica Further investigation of the phenomenon in plants indicated that the downregulation was due to post-transcriptional inhibition of gene expression via an increased rate of mRNA degradation.[144] This phenomenon was called co-suppression of gene expression, but the molecular mechanism remained unknown.[145] Transcrito Traduzido

37 Virologistas que trabalhavam Resistência de plantas A certos vírus
Depois de algum tempo... Virologistas que trabalhavam Resistência de plantas A certos vírus Observaram um fenômeno parecido Not long after, plant virologists working on improving plant resistance to viral diseases observed a similar unexpected phenomenon.

38 Pesquisadores observaram que...
Plantas que expressaram Proteínas específicas virais mostraram Aumento da Tolerância Resistência Infecção Viral O que não se esperava é que Plantas que transportavam apenas Curtas regiões não codificantes De sequencias de RNA viral Mostrariam níveis semelhantes de Proteção plants expressing virus-specific proteins showed enhanced tolerance or resistance to viral infection, it was not expected that plants carrying only short, non-coding regions of viral RNA sequences would show similar levels of protection. não se esperava que as plantas que transportam apenas curtos, regiões não codificantes de sequências de RNA viral mostraria níveis semelhantes de protecção.

39 O que os pesquisadores acreditaram
É que o RNA viral produzido pelo transgene De alguma maneira Também inibia a replicação viral Desta maneira Um experimento reverso foi realizado Pequenas sequencias de genes de plantas Foram introduzidas em vírus Que foram infectados em plantas Demonstrou-se que os genes alvos Foram suprimidos nas plantas infectadas Vírus induzindo o silenciamento gênico Silenciamento gênico Pós-Transcricional Researchers believed that viral RNA produced by transgenes could also inhibit viral replication.[146]  The reverse experiment, in which short sequences of plant genes were introduced into viruses, showed that the targeted gene was suppressed in an infected plant. This phenomenon was labeled "virus-induced gene silencing" (VIGS), and the set of such phenomena were collectively called post transcriptional gene silencing.[147]

40 Após essas observações em plantas...
Diversos laboratórios De várias partes do mundo Passaram a trabalhar com Esta metodologia Em outros organismos 1998 – Craig C. Mello e Andrew Fire After these initial observations in plants, many laboratories around the world searched for the occurrence of this phenomenon in other organisms.[148][149]  Craig C. Mello and Andrew Fire's 1998 Nature paper reported a potent gene silencing effect after injecting double stranded RNA into C. elegans.[150]  In investigating the regulation of muscle protein production, they observed that neither mRNA nor antisense RNA injections had an effect on protein production, but double-stranded RNA successfully silenced the targeted gene. As a result of this work, they coined the term RNAi. Fire and Mello's discovery was particularly notable because it represented the first identification of the causative agent for the phenomenon. Fire and Mello were awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 2006 for their work.[2] Trabalhando com C. elegans

41 Os autores estudaram... Um gene relacionado A musculatura do verme E através de uma injeção introduziram Um RNA sense Um RNA antissense Um RNA duplafita = sense/antissense Observando que...

42 Forma do verme (fenótipo)
Eles estudaram um gene Apenas a injeção que continha a dupla fita de RNA alterava a Forma do verme (fenótipo)

43 Além disso os autores demonstraram que:
O silenciamento só ocorre se o RNA injetado for dupla fita (RNAdf). Embora ocorra pequena diminuição da expressão com RNAsf O silenciamento foi específico para um RNAm homólogo ao RNAdf O RNAdf liga-se somente a uma sequencia de RNAm madura, não se ligando ao íntron, ou a sequencias promotoras Indicando um mecanismo citoplasmático póstranscricional First, silencing was triggered efficiently by injected dsRNA, but weakly or not at all by sense or antisense singlestranded RNAs. Second, silencing was specific for na mRNA homologous to the dsRNA; other mRNAs were unaffected. Third, the dsRNA had to correspond to the mature mRNA sequence; neither intron nor promoter sequences triggered a response. This indicated a posttranscriptional, presumably cytoplasmic mechanism.

44 Sugerindo que ele foi degradado Apenas poucas moléculas de RNAdf
Continuando.... O RNAm desapareceu Sugerindo que ele foi degradado Apenas poucas moléculas de RNAdf Foram suficientes para o total silenciamento Indicando que o RNAdf atuou cataliticamente RNAdf espalhou-se entre os tecidos Sugerindo a transmissão entre as células Fourth, the targeted mRNA disappeared suggesting that it was degraded. Fifth, only a few dsRNA molecules per cell were sufficient to accomplish full silencing. This indicated that the dsRNA was amplified and/or acted catalytically rather than stoichiometrically. Sixth, the dsRNA effect could spread between tissues and even to the progeny, suggesting a transmission of the effect between cells. Furthermore, Fire and Mello made the remark that RNAi could provide an explanation for a phenomenon studied in plants for several years: posttranscriptional gene silencing (PTGS). Finally, they ended their paper by speculating about the possibility that “dsRNA could be used by the organism for physiological gene silencing”.

45 Demonstrassem tantos pontos Eles não falaram se o mecanismo de RNAi
Embora os autores... Demonstrassem tantos pontos Eles não falaram se o mecanismo de RNAi Atuava via Transcricional Póstranscrional 1998 – Fire – PNAS – Demonstrou que RNAm é o alvo do RNAdf e que RNAm é degradado antes da tradução RNAdf exerce seu efeito no nível póstranscricional ver que mRNA é o alvo para ARNdc (reconhecimento através cadeias complementares), e que o mRNA-alvo é degradado antes da tradução, isto é, ARNdcexerce o seu efeito no nível de posttranscriptional

46 Ele também demonstrou como...
Um modelo específico De como uma cadeia dupla de RNA Seria um alvo específico Para a degradação De um RNAm Este modelo diferenciava do modelo Simples fita No qual um RNAsf antissense e ligava ao RNAm Degradando este Ele também apresentou um modelo específico mostrando como de cadeia dupla de RNA poderia funcionar de uma maneira catalític apara alvejar homóloga mRNAs para a degradação.  Este modelo diferia notavelmente a partir do modelo simples de anti-sentido que tempo, o que apenas previu interacção entre um interferindo molécula de RNA de cadeia simples e mRNA.  Pode ser acrescentado que no presente documento PNAS, Fire tambémindicou a possibilidade de que o RNAi mecanismo poderia ser uma abordagem específica "tática" para a defesa viral em organismos inferiores (a ser comparado com a resposta global no interferão mamíferos).

47 Fire e Melo Ganhadores do Premio Nobel de 2006

48 Com o passar dos anos foi descoberto que...
Outros organismos também possuiam O sistema de RNAi Within a year, the presence of RNAi had been documented in many other organisms, including fruit flies, trypanosomes, plants, planaria, hydra and zebrafish

49 Experimentos iniciais
Cultura de células de mamíferos Elas não reagiram muito bem A longos RNAdf Não respondendo bem ao tratamento Mas quando os pesquisadores utilizaram RNAdf com 21 a 25 nucleotídeos Todas as células apresentaram resposta 5’ 3’ 3’ 5’ Sense/antissense

50 A bioquímica e via do RNAi
Foi primeiramente elucidada em Um sistema de embriões in vitro Drosophila E depois de vários anos concluíram que: O longo RNAdf formado é quebrado Em pequenos fragmentos que serão Processados e utilizados como moldes Para degradarem Um RNAm específico

51 Este RNA dupla fita longo...
É clivado em fragmentos menores De 20 a 25 nucleotídeos Enzima DICER Fragmentos menores são conhecidos como RNAsi DICER The RNAi pathway is found in many eukaryotes including animals and is initiated by the enzyme Dicer, which cleaves long double-stranded RNA(dsRNA) molecules into short fragments of ~20-25 nucleotides.

52 Este RNAsi (smal interfering RNA) é então separado...
These short double-stranded fragments are called small interfering RNAs (siRNAs). These siRNAs are then separated into single strands and integrated into an active RISC complex. After integration into the RISC, siRNAs base-pair to their target mRNA and induce cleavage of the mRNA, thereby preventing it from being used as a translation template.[11] ...Em fitas simples

53 Uma das duas fitas de cada fragmento Conhecida como fita guia do RNAsi
É incorporada pelo Complexo Indutor de Silenciamento do RNA (RISC) Enquanto a outra fita é degrada Complexo Formado por muitas proteínas – Argonautas Nessas proteínas se ligam a fita guia Direcionando o silenciamento gênico  which cleave the target mRNA strand complementary to their bound siRNA.[1] As the fragments produced by dicer are double-stranded, they could each in theory produce a functional siRNA. However, only one of the two strands, which is known as the guide strand, binds the argonaute protein and directs gene silencing. The other anti-guide strand orpassenger strand is degraded during RISC activation.[23] Although it was first believed that an ATP-dependent helicase separated these two strands,[24] the process is actually ATP-independent and performed directly by the protein components of RISC.[25][26] The strand selected as the guide tends to be the one whose 5' end is least paired to its complement,[27] but strand selection is unaffected by the direction in which dicer cleaves the dsRNA before RISC incorporation.[28]  Instead, the R2D2 protein may serve as the differentiating factor by binding the more-stable 5' end of the passenger strand.[29]

54 A Fita Guia é incorporada pelo complexo RISC
AGO RISC A fita guia , orienta o local da clivagem do RNAm uma vez que ela é semelhante a essa região AGO RISC RNAm A Fita Guia é incorporada pelo complexo RISC O Complexo RISC através de sua enzima Argonauta cliva o RNAm degradando-o

55 Além dos RNAsi existem também os microRNA
São moléculas de RNA 19 a 25 nucleotídeos Não codificantes de proteínas Agem como reguladores Póstranscricionais da expressão gênica Plantas Animas SÃO moléculas de RNA fita simples de 19–25 nucleotídeos, não codificadores de proteínas, que agem como po- tentes reguladores pós-transcricionais da expressão gênica em plantas e animais

56 Até o presente momento acredita-se...
Que aproximadamente 462 miRNAs foram identificados Em Humanos Estudos bioinformáticos estimam que Este número supere 1000 miRNAs, constituindo uma das Maiores classes de Reguladores gênicos Até o momento, 462 miRNAs diferentes foram identificados em humanos, e estudos bioinformáticos estimam que este número supere 1000 miRNAs, constituindo uma

57 A região 3’ não traduzida do RNAm alvo Impedindo que ocorra a tradução
Como os miRNA atuam? Ligando-se A região 3’ não traduzida do RNAm alvo Impedindo que ocorra a tradução De determinada proteína Diminuindo a sua expressão Estudos recentes demonstraram que: Alterações da expressão de miRNA Ocorrem em diferentes patologias humanas Dentre elas o Câncer Estudos recentes enfatizam a importância destas moléculas ao relatar alterações na expressão dos miRNAs em diferentes patologias humanas. Neste artigo, sintetizamos aspectos da biologia dos miRNAs e as atuais descobertas associando estas moléculas à fisiopatologia endócrina e câncer.

58 Biogênese do miRNA (NÙCLEO)
Transcrição de seu gene pela RNApolimerase II Gerando um longo transcrito de miRNA que após processado apresentará a cauda poli-A a região cap 5´e uma região hairpin RNA polimerase II GENE miRNA Biogênese dos miRNAs A biogênese do miRNA, esquematizada na figura 1, inicia-se com a transcrição de seu gene pela RNA polimerase II, gerando um longo transcrito de miRNA primário (pri-miRNA) contendo cap 5’ e cauda poli(A) (7). O pri-miRNA apresenta uma estrutura hairpin em seu arcabouço que é clivada ainda no núcleo pela RNase III, Drosha, e seu cofator DGCR8 (do inglês DiGeorge syndrome critical region gene 8), gerando uma molécula precursora do miRNA maduro denominada pré-miRNA, com cerca de 70 nucleotídeos (8). Em seguida, o prémiRNA é transportado rapidamente ao citoplasma pela exportina-5 (Exp5), proteína de exportação nuclear que utiliza Ran-GTP como co-fator (9). No citoplasma, o pré-miRNA é processado pela RNase III, Dicer, gerando um miRNA fita dupla de aproximadamente 22 nucleotídeos (10). Este produto é incorporado a um complexo multimérico denominado RISC (do inglês RNA-induced silence complex), que inclui as proteínas Argonautas como principais componentes. Apenas uma das fitas do duplex de miRNA permanece no complexo RISC para controlar a expressão pós-transcricional de genes-alvo (11). A expressão alterada de componentes da maquinaria de biogênese dos miRNAs como Drosha, Dicer e Argonautas, tem sido associada a diferentes tumores humanos, destacando a importância desta via no funcionamento celular adequado (12).

59 Sofre a ação da enzima DROSHA e seu cofator DGCR8
POLI-A CAP-5’ Pri-miRNA Sofre a ação da enzima DROSHA e seu cofator DGCR8 Pré-miRNA 70 nucleotídeos DROSHA DGCR8 POLI-A CAP-5’ Gerando uma molécula precursora de miRNA madura denominada pré-miRNA que sairá do núcleo e será transportada Para o citoplasma A biogênese do miRNA, esquematizada na figura 1, inicia-se com a transcrição de seu gene pela RNA polimerase II, gerando um longo transcrito de miRNA primário (pri-miRNA) contendo cap 5’ e cauda poli(A) (7). O pri-miRNA apresenta uma estrutura hairpin em seu arcabouço que é clivada ainda no núcleo pela RNase III, Drosha, e seu cofator DGCR8 (do inglês DiGeorge syndrome critical region gene 8), gerando uma molécula precursora do miRNA maduro denominada pré-miRNA, com cerca de 70 nucleotídeos (8).

60 o prémiRNA é transportado rapidamente ao citoplasma pela exportina-5 (Exp5), proteína de exportação nuclear que utiliza Ran-GTP como cofator NÚCLEO EXP-5 RAN-GTP CITOPLASMA

61 No citoplasma o pré-miRNA
Será clivado pela enzima DICER Gerando um miRNA fita dupla De aproximadamente 22 nucleotídeos DICER No citoplasma, o pré-miRNA é processado pela RNase III, Dicer, gerando um miRNA fita dupla de aproximadamente 22 nucleotídeos (10).

62 Este miRNA separado em fitas simples
Este produto é incorporado a um complexo multimérico denominado RISC (do inglês RNA-induced silence complex), que inclui as proteínas Argonautas como principais componentes. Apenas uma das fitas do duplex de miRNA permanece no complexo RISC para controlar a expressão pós-transcricional de genes-alvo (11).

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64 Ou pelo bloqueio da tradução de proteínas
a complementaridade não necessita ser completa o que indica que um único miRNA pode regular centenas de genes, e cada gene-alvo pode ser regulado por múltiplos miRNA, demonstrando a complexidade dessa rede de regulação gênica.

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66 COMO ISSO PODE SER UTILIZADO A NOSSO FAVOR?
A descoberta do processo de regulação gênica através de RNA interferência revolucionou a forma como se estuda o papel de genes específicos na biologia. Porque?

67 Porque o uso de RNAduplafita (RNAdf) exógeno como ferramenta
Reduz a expressão de determinados RNAm Diminuindo a produção de sua proteína Alterando muitas vezes a função celular Como o RNAm não estará sendo expresso Vc poderá estudar Gene. O uso de moléculas de RNAdf exógenas como ferramenta pode reduzir a expressão de genes específicos (efeito conhecido como knock-down), de forma que as alterações causadas por essa estratégia possibilitam avaliar quais funções esse gene desempenha na célula. Nesses experimentos, a sequência da molécula de RNAdf é definida pelo pesquisador para interferir no seu gene- alvo preferido. Essa estratégia também pode ser usada diretamente in vivo (em animais ou mesmo em humanos), e daí a possibilidade de desenvolvimento de fármacos (Tiemann & Rossi, 2009).

68 Além disso, é uma técnica que é utilizada
Possibilitando o desenvolvimento de

69 Fármacos duas abordagens distintas podem ser usadas
Para silenciar RNAm alvos, ou diminuir a expressão de proteínas alvo, ou tentar estudar genes alvo. PRIMEIRA Vetores Virais São introduzidos nas células Expressarão genes Que serão transcritos em molécus RNAdf Similares ao miRNA Essas moléculas parecidas com miRNA ficaram conhecidas como shRNA (Short Hairpin)_ Na primeira, vetores genéticos, em geral derivados de vírus (como adenovírus, retrovírus ou vírus adenoassociados), são transduzidos nas células, de modo a expressar genes que são transcritos em moléculas de RNAdf na forma de grampo (similares aos mi RNA). Essas moléculas são conhecidas como shRNA (do inglês short hairpin RnA) e têm como alvo o gene que se deseja silenciar

70 shRNA Clivado pela proteína DROSHA Processado pela maquinaria do RNAi
Terá como resultado Diminuição da expressão do que se quer Problema desta metodologia é a produção De vetores virais O que não é um processo simples Do ponto de vista Farmacêutico Embora existam outros vetores sendo testados em humanos expressando shRNA . O sh RNA é clivado pela proteína Drosha e assim é processado pela maquinaria de RNA interferência celular. Apesar de esse tipo de abordagem requerer a produção de vetores virais, o que não é um processo simples do ponto de vista de produção de fármacos, ainda assim, como veremos adiante, há algumas estratégias terapêuticas que estão sendo testadas, como protocolos clínicos em humanos, empregando vetores que expressam sh RNA

71 Pequenas moléculas de RNAdf Conhecidas como RNAsi
Segunda abordagem Pequenas moléculas de RNAdf Conhecidas como RNAsi Introduzidas em culturas de células Por diversos tipos de metodologias Permitem a degradação específica Do RNAm alvo Atualmente várias empresas de biotecnologia Oferecem moléculas de RNAsi Para qualquer RNAm Humano ou de Camundongo Que se pretende silenciar Em uma segunda abordagem, pequenas moléculas de RNAdf podem ser introduzidas diretamente nas células em cultura, visando à degradação específica do gene-alvo. Essas moléculas são conhecidas como si RNA (small interfering RnA) e podem ser introduzidas na célula, por vários tipos de metodologias, para o silenciamento de seu gene-alvo. Atualmente, várias empresas de biotecnologia oferecem moléculas de si RNA, para qualquer gene humano (ou camundongo) que o pesquisador pretenda silenciar.

72 Uma característica importante é que
O tamanho do fragmento Tem que ter sempre entre 19 e 30 pb Pois fragmentos maiores Induzem respostas interferon inespecificas nas células animais Gerando apoptose celular Uma característica importante é o tamanho da duplex que deve ter de 19 a 30 pares de base, uma vez que tamanhos maiores podem induzir respostas interferon inespecíficas em células animais.

73 A introdução da molécula de siRNA É feita através da formação
Cultura de Células A introdução da molécula de siRNA É feita através da formação Complexos dessas com Polímeros Químicos Lipídios Catiônícos O complexo é endocitado pela célula RNAdf são liberados no citoplasma Sendo liberados pela maquinaria RNAi Promovendo o silenciamento Do RNAm alvo Em cultura de células, a introdução de moléculas de siRNA é, em geral, feita através da formação de complexos dessas duplexes com polímeros químicos ou lipídeos, normalmente catiônicos. O complexo é endocitado pelas células e as duplexes de RNA são liberadas no citoplasma, sendo processadas pela maquinaria de RNA interferência, promovendo o silenciamento do gene-alvo.

74 Reavivando a Memória

75 A utilização de RNAsi Tem sido amplamente empregada
Nos estudos de genômica funcional Em distintos testes clínicos Devido ao silenciamento gênico Específico e robusto desta molécula A fácil manipulação e a existência de RNAsi para qualquer RNAm Do genoma humano Tornaram acessível o uso dessa Ferramenta Por diferentes grupos de pesquisa aplicada e básica A utilização de si RNA tem sido largamente empregada em estudos de genômica funcional e em distintos testes clínicos em razão do silenciamento gênico específico e robusto induzido por essas moléculas. A fácil manipulação e a existência de sequências de si RNA para qualquer gene do genoma humano tornaram acessível o uso dessa ferramenta por diferentes grupos de pesquisa básica e aplicada.

76 Interferindo na expressão gênica in vivo
A descoberta do mecanismo de RNAi Em células humanas é recente Mas rapidamente verificou-se o seu uso Como terapia em animais Maior parte dos testes pré-clínicos A descoberta dos mecanismos de RNA interferência em células humanas é relativamente recente, mas, apesar disso, rapidamente verificou-se que o uso de RNAdf como ferramenta também pode ser feito in vivo, diretamente em animais. Obviamente, a maior parte desses testes pré-clínicos tem sido feita em camundongos, mas animais maiores, como macacos, também têm sido usados, e os resultados têm sido promissores.

77 Isso estimulou o desenvolvimento...
...de diversos estudos em humanos E vários protocolos clínicos Estão testados para Isso estimulou o desenvolvimento de estudos diretamente em humanos, e vários protocolos clínicos já estão sendo testados. O potencial terapêutico de silenciamento através de RNA tem sido investigado tendo como alvo vários tipos de doenças, como câncer, doenças respiratórias, inflamação, doenças neurológicas, autoimunes e no combate a processos infecciosos (Figura 2).

78 Alguns protocolos clínicos em fase I
Que testam a segurança do uso em humanos Já foram concluídos e se verificou que A molécula de RNAsi Foram introduzidas em pessoas Sem que se apresentasse efeito tóxico Com silenciamento do RNAm alvo. Alguns protocolos clínicos em fase I, que testam a segurança do uso de terapias em humanos, já foram concluídos e se verificou que moléculas de si RNA foram introduzidas em pessoas sem que se verificasse efeito tóxico. Mais do que isso, em vários casos identificou-se o funcionamento dessas duplexes no silenciamento do gene-alvo, como desejado.

79 O desenvolvimento de terapias Baseadas em RNAi tornou-se
Além disso... O desenvolvimento de terapias Baseadas em RNAi tornou-se Um campo promissor Uma vez que a inibição de Determinadas proteínas não teve sucesso Pela farmacologia tradicional O desenvolvimento de terapias baseadas em RNAi tornou-se um campo de pesquisa atrativo e promissor sobretudo nos casos em que a inibição de determinadas proteínas não teve sucesso pelos métodos farmacológicos tradicionais.

80 O desenvolvimento de RNAdf
Só depende do conhecimeno Da sequencia do RNAm alvo Sendo a droga a ser desenvolvida Extremamente mais simples Uma vez que não se precisa conhecer A estrutura cristalográfica da proteína Além disso, como o desenvolvimento de duplexes de RNA só depende do conhecimento da sequência do gene-alvo, o desenvolvimento dessas drogas é extremamente simples em relação ao tradicional drug design, no qual há necessidade de conhecimento da estrutura cristalográfica da proteína-alvo, o que não é garantia de sucesso em determinar os ligantes ativos nessas estruturas.

81 Existirem casos que os RNAdf Atuam em mais de um RNAm
Apesar de... Existirem casos que os RNAdf Atuam em mais de um RNAm Efeito conhecido como off-target Mas vários protocolos experimentais Demonstraram a especificidade Dada pela sequencia dessas moléculas O que estimula novas pesquisas Na área Apesar de existirem casos nos quais as duplexes podem atuar em alvos diferentes do previsto (efeito conhecido como off-target), vários protocolos experimentais têm demonstrado a especificidade dada pela sequência dessas moléculas, o que estimula novas pesquisas na área.

82 Os trabalhos utilizam as metodologias
Em geral... Os trabalhos utilizam as metodologias Já descritas para os procedimentos De terapia gênica tradicional Entretanto, algumas diferenças entre o uso dessas duas abordagens são claras e devem ser levadas em conta na escolha da metodologia Em geral, os trabalhos empregam as metodologias já bastante investigadas para introdução de DNA em organismos, em procedimentos de terapia gênica tradicional. Entretanto, algumas diferenças entre o uso dessas duas abordagens são claras e devem ser levadas em conta na escolha da metodologia

83 É muito menor que a molécula de DNA
A molécula de RNAsi É muito menor que a molécula de DNA O que facilita a sua interiorização Além disso, o RNAsi É uma molécula muito mais instável in vivo Essa característica exigiu diversos estudos em modificações químicas que aumentam sua estabilidade no organismo, sem prejudicar a ação dessas moléculas como fármacos. . A molécula de si RNA é muito menor (entre 19 e 30 pares de bases), o que facilita sua entrega em relação aos vetores genéticos dependentes de DNA ou RNA (em geral alguns milhares de pares de base). Apesar disso, RNA é uma molécula muito mais instável, sendo degradada in vivo por RNAse. Essa característica exigiu diversos estudos em modificações químicas que aumentam sua estabilidade no organismo, sem prejudicar a ação dessas moléculas com fármacos.

84 Através de várias vias de administração
RNAsi ou RNAsh Através de várias vias de administração O que dependerá do RNAm do tecido-alvo A ser analisado ou avaliado Aplicações Intravenosas Diretamente para o Fígado Onde é interiorizado Pelas células Os testes com animais empregam si RNA ou shRNA através de várias vias de administração, o que depende do gene e do tecido-alvo. Por exemplo, aplicações intravenosas possibilitam que a duplex seja direcionada especialmente ao fígado, onde é interiorizado nas células.

85 Vias de Administração Intraocular garante um efeito direto nesse órgão, com a vantagem do olho ser um compartimento de tamanho limitado, o que possibilita o uso de poucas moléculas, que ainda são efetivas no silenciamento gênico. Inalação muito sucesso o emprego de aplicação de RNAdf através de inalação quando o alvo são as vias aéreas.

86 Vias de Administração Pele o que possibilita um alcance em vários pontos do organismo, ainda que preferencialmente em tecidos mais superficiais. Mas como esses RNAdf são administrados?

87 Vetores Vírus Complexos Químicos Nanopartículas Bactérias

88 Interferindo no genoma humano com fins terapêuticos
Apesar de sabermos que o mecanismo De RNAi existe em células humanas Desde 2001 É surpreendente como Protocolos clínicos em seres humanos Empregando esta técnica foram desenvolvidos rapidamente Apesar de sabermos que o mecanismo de RNA interferência existe em células humanas há relativamente pouco tempo (desde 2001), é surpreendente como rapidamente foram iniciados protocolos clínicos em seres humanos empregando RNAi.

89 Essa rapidez e relativo sucesso
Permitem prever que em poucos anos Teremos essas moléculas sendo Comercializadas Em nossas Farmácias Aplicadas em nossos Hospitais. Entre as principais indicações de uso RNAi Destacam-se Terapias oftalmológicas Essa rapidez e relativo sucesso em alguns desses protocolos permitem prever que, em poucos anos, teremos essas moléculas sendo comercializadas em nossas farmácias e/ou aplicadas em nossos hospitais (Tiemann & Rossi, 2009). Entre as principais indicações de uso de RNA interferência, destacamse aquelas envolvidas em terapias oftalmológicas.

90 A compartimentalização ocular Permite injeções diretas
Isso se deve porque A compartimentalização ocular Permite injeções diretas Na cavidade vítrea que são livres De nucleases portanto As RNAsi São facilmente internalizadas pelas células-alvo Vitravene®, Novartis e Macugen®, Pfizer Retinite por Citomegalovírus Isso se deve basicamente à compartimentalização ocular, que permite a administração direta com injeções na cavidade vítrea. doença macular relacionada à idade O compartimento ocular é livre de nucleases e moléculas de si RNA são internalizadas nas células-alvo

91 Além disso, Com duplexes de siRNA
Os testes clínicos têm se concentrado no tratamento de doença macular relacionada à idade Testes clínicos de fase II/III, Empregando 217 pacientes, indicaram uma melhora na acuidade visual em dois terços desses, demonstrando que essa tecnologia Pode estar próxima de ser aprovada para comercialização

92 Protocolo Clínico na Fase II
Está sendo realizado para combater a infecção respiratória por vírus sincicial RNAi são inalados pelos pacientes 88 indivíduos que receberam o RNAi Não foram infectados em relação aqueles que receberam o placebo Testes clínicos com 88 indivíduos adultos sadios demonstraram que as moléculas de si RNA foram seguras e houve níveis significativamente menores de infecção em relação a indivíduos que receberam placebo

93 A corrida do ouro no desenvolvimento de novas terapias com RNAi
A descoberta dos mecanismos de RNA interferência, apesar de recente, provocou uma verdadeira revolução na forma como é estudado o funcionamento dos genes nas células e também abriu perspectivas de intervenção direta na ação gênica in vivo. Em vários casos de doenças humanas, ocorre aumento de expressão de determinados genes, e o controle desses pelo silenciamento aparece como uma esperança na obtenção de novas formas de terapia.

94 Esforços para uso dessa nova biotecnologia na clínica têm correspondido a um dos mais importantes exemplos recentes de medicina translacional, na qual o teste de laboratório é transferido rapidamente para o leito do paciente. Os desafios ainda são grandes, havendo necessidade de novas estratégias para maximizar a ação das moléculas efetoras dentro das células, assim como dos mecanismos de administração e entrega da molécula aos órgãos-alvo.

95 Várias são as estratégias propostas, na teoria, para o direcionamento dessas moléculas de modo a garantir melhor especificidade no tecido-alvo, mas há necessidade de testes que possibilitem a demonstração de efetividade na prática. Os desafios, porém, não parecem assustar as grandes empresas farmacológicas do mundo inteiro Uma vez que estão dispostas a investir bilhões de dólares nesta nova metodologia. Embora esta metodologia deve ser analisada com cautela, visto que ainda requer intenso trabalho de pesquisa em todo o processo de elaboração de protocolos terapêuticos