Leveduras são fungos unicelulares que se dividem por gemação; São micro-organismos eucarióticos que sobrevivem em condições bastante estressantes; O gênero.

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2 Leveduras são fungos unicelulares que se dividem por gemação; São micro-organismos eucarióticos que sobrevivem em condições bastante estressantes; O gênero Saccharomyces é o mais conhecido e mais utilizado industrialmente para panificação, cervejarias, vinícolas, destilados e etanol combustíveis.

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5 O complexo Saccharomyces sensu stricto, foi proposto por Van der Walt em 1970, que selecionou 21 espécie de leveduras deste gênero associadas a fermentação; Em 1984 Yarrow, reduziu todos estes gêneros a uma só espécie Saccharomyces cerevisiae; A partir 1987, com o uso de técnicas de biologia molecular, foram reclassificas novamente em diferentes espécies, utilizadas na industria de alimentos; Saccharomyces bayanus (vinhos e sidra), S. cerevisiae, (cerveja ale, vinho pão, saquê) S. pastorianus (cerveja lager); Existem muitas diferenças taxonômicas entre S. bayanus e S. pastorianus, estima-se que diversas espécies originaram da hibridização.

6 As cervejas tipo ale, surgiram provavelmente a 4000 anos a.C, elaboradas provavelmente com leveduras Saccharomyces cerevisiae; As cervejas tipo lager, produzidas em temperaturas mais baixa, surgiu na Idade Média, na região da Bavária; Estas cervejas ganharam popularidade no final do seculo XIX, com a descoberta da refrigeração; A levedura S. pastorianus (lager) difere genética e fisiologicamente da S.cerevisiae (ale), que parece ter sido originada de uma resposta ao estresse causado pela pressão e fermentação a baixas temperaturas; A seleção de leveduras lager, surgiu no século XVI, provocada pelas fermentações em baixas temperatura, por que a Lei da Bavaria, proibia a produção de cerveja durante o verão.

7 Tem se demonstrado que as leveduras lager são micro-organismos hibridos, que surgiram por um processo de especiação instantânea pela hibridização interespecífica; A hibridização interespecífica ou alopoliploidia, ocorre entre as espécies de leveduras Saccharomyces sensu estricto ocorrem de forma natural em um meio industrial; A hibridização interespecífica podem ter acontecido para originar o aparecimento da variedade lager; Provocou a união dos genomas das espécies Saccharomyces bayanus e Saccharomyces cerevisiae;

8 Qual é a vantagem de se utilizar um micro-organismo hibrido? Obtém as características dos micro-organimos parentais; Perfil aromático da S.cerevisiae e maior capacidade de fermentar em baixas temperatura da S. bayanus

9 As Leveduras e as Cervejas Leveduras Ale: predominantemente S. cerevisiae - Algumas cepas: híbridos de S. cerevisiae e S. kudriavzevii; Leveduras Lager: espécie domesticada de S. pastorianus (híbrido S. cerevisiae + S. eubayanus): Exclusiva do meio produtivo e ausente naturalmente no ambiente. elevado grau de resistência à diferentes condições de estresse (baixas temperaturas, pH baixo, concentrações elevadas de etanol, elevada pressão osmótica e anaerobiose).

10 Leveduras: Lager x Ale LagerAle Leveduras de baixa fermentaçãoLeveduras de alta fermentação S. cerevisiae (= Saccharomyces uvarum = S. carlsbergensis) S. pastorianus (híbrido S. cerevisiae + S. eubayanus) S. cerevisiae (STEWART, 2000) Algumas cepas: híbridos de S. cerevisiae e S. kudriavzevii 7 < T(°C) < 1518 < T(°C) < 22 (GIUDICI et al., 1998) Final da fermentação: floculam e precipitam (7 a 10 dias) Células se elevam à superfície do líquido formando biomassa (3 a 5 dias) Fermentam melobiose Possuem genes MEL → enzima extracelular α-galactosidase (Melibiase = glicose + galactose) Não fermentam melobiose, somente algumas (TURAKAINEN et al., 1993) Não crescem em temperaturas > 34°CPodem crescer a 37°C (STEWART e RUSSELL, 1998) Glicose: inibe o consumo da maltose de alta afinidade Glicose: não inibe o consumo da maltose de alta afinidade

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12 Em 1876, identifica-se as leveduras e aplica-se a pasteurização para estabilizar as cervejas; Em 1883, Emil Hansen, demonstra as vantagens de se produzir cerveja com cepas selecionadas; O emprego do Processo CIP; O uso de cepa pura e monitorada genéticamente; O emprego da aeração no recipiente de propagação; Provoca: Melhoria da qualidade; Redução de custos; Competitividade

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21 Seleção de leveduras boas produtoras de Cachaça Início rápido da fermentação Não produzir ácido acético Produzir componentes do aroma (ácidos orgânicos, ésteres) Tolerância a alta pressão osmótica Alto rendimento alcoólico e boa produtividade em etanol Produção mínima de SO 2 Não produzir espuma excessivamente Produção de fator Killer Característica de floculação Relativa resistência para baixo valor de pH Baixo requerimento de vitaminas, ácidos graxos e oxigênio Fermentar rapidamente e completamente o caldo Tolerância a altas concentrações de etanol Tolerância a altas temperaturas

22 Em altas concentrações a glicose reprime a respiração e a célula acaba produzindo mais ATP, por unidade de substrato metabolizado; Induz a fermentação, produzindo menos ATP, por unidade de substrato; Portanto, quando se há fermentação, produz se menos quantidade de biomassa

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24 Fonte de carbono para obtenção de energia e formação da parede celular; Fonte de nitrogênio para síntese de proteínas e outros compostos nigrogenados; FAN: mínimo 150 ppm; Sais e minerais; Fatores de Crescimento.

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26 N=N o *2 n N: número total de células; N o :número de célula no início do processo; N: número de gerações;

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33 PROCESSO CONTÍNUO: produz alta concentração de álcool e baixa produção de biomassa; PROCESSO DESCONTÍNUO ALIMENTADO: Inicia com uma baixa concentração de açúcar (0,5%) e vai suplementando a medida que a célula necessita: Baixa concentração de álcool; Alta concentração de biomassa; Processo mais difícil de ser empregado em microcervejarias; Mais propício a contaminaçao.

34 CEPAS PURAS: encontradas em laboratórios específicos e bem controladas; PROPAGAÇÃO: em industrias especializadas com baixas condições de higienização; SECAGEM: leito fluidizado; MERCADO: liberada somente após rigorosos testes de fermentação, controles microbiológicos e viabilidade; ARMAZENAMENTO: até dois anos.

35 PROPAGAÇÃO NA PLANTA: para trabalhar sem risco se torna em processo custoso; MICROCERVEJARIA: muito arriscado e incômodo; Problemas microbiológicos frequentes; Dificuldade de utilizar mais de uma cepa em cada vez.

36 LEVEDURAS SECAS: Menor custo; Qualidade microbiológica segura; Possível de usar a quantidade de células desejadas, simplesmente pesando; Não necessita de laboratórios; Reduz a quantidade de oxigênio dissolvido no início da fermentação; Possibilidade de utilizar varias cepas na mesma hora;

37 As leveduras propagadas em sistema descontínuo alimentado, produz leveduras de ótima qualidade para o processo cervejeiro Possibilidade de utilizar varias cepas na mesma hora; laboratóriofermentaçãocentrifugaçãoestocagemfiltraçãosecagem

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39 hidrataçãoLevedura secafermentação

40 ATIVIDADE: cepas tipo lager, não mostram muita atividade na superfície; Cepas tipo ale, tem muita atividade na superfície; Varia com a temperatura ESTABILIDADE Uma população com pouca estabilidade genética, modificará comprometendo a qualidade da cerveja. TEMPERATURA Cepa tipo lager: ótima 7-15 o C; Cepa tipo ale: ótima 16-22 o C Baixa temperatura pode provocar uma floculação precosse; Importante evitar mudanças bruscas de temperatura; A atividade metabólica depende da temperatura; A produção de compostos aromáticos, depende da temperatura.

41 pH Ótimo entre 4,8 e 5,2; Durante a fermentação diminui entre 3,9 e 4,1; pH muito baixo, torna propício para o crescimento da maioria dos micro-organismos contaminantes; TOLERÂNCIA AO ÁLCOOL: Efeito da toxidade do álcool são diversos, A parede celular parece ficar mais afetada; A regidez da membrana, devido ao desbalanço entre ácidos graxos saturados e insaturados e ausência de ergosterol; Inibição do crescimento; Diminuição do volume celular; Diminuição da taxa de respiração; Diminuição do crescimento; Indução de mutantes deficientes.

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43 A atenuação mede o grau de conversão de açúcares em álcool, durante a fermentação; Em muitos países a classificação de uma cerveja como forte ou fraca se fundamenta exclusivamente no conteúdo de extrato original do mosto, ou seja, o teor de açúcar contido em 100 g de mosto; De acordo com Balling, cada 2,0665 g de extrato do mosto, produz após a fermentação 1g de álcool, 0,9565g de CO 2 e 0,11g de levedura; As duas últimas substâncias somam 1,0665 g, que teriam que ser eliminadas completamente da cerveja acabada, para realizar os procedimentos analíticos após a evaporação; 1g Extrato = 0,4839g etanol + 0,4629g CO 2 + 0,0532g levedura

44 EXTRATO APARENTE E GRAU DE ATENUAÇÃO APARENTE Usando um densímetro, pode se determinar as gravidades específicas antes e depois da fermentação; Estas medidas são obtidas pela leitura direta utilizando um hidrômetro, ou pela leitura direta com um densímetro graduado em Grau Plato; Quando estas medidas determinadas na cerveja, devido a presença do álcool o valor obtido não é real, porque a densidade do álcool interfere na medição; O Valor obtido é então denominado de Extrato Aparente (EA); Conhecido o Extrato Aparente, pode se determinar o Grau de Atenuação Aparente:

45 EXTRATO REAL (Extrato Seco) E GRAU DE ATENUAÇÃO REAL O etanol tem uma densidade de 0,79 g/cm 3 a 20°C, por isso, a sua presença na cerveja reduz a gravidade específica da mesma em relação ao mosto; O Extrato Real, em grau Plato, é a quantidade de açúcar que foi convertido em álcool durante a fermentação, desconsiderando o efeito do álcool, onde o Extrato Real (ER), pode ser estimado, conhecendo-se a concentração alcoólica da cerveja; Conhecendo o Extrato Real, pode se determinar o Grau de Atenuação Real da cerveja Relação entre GAR e GAA

46 EXTRATO REAL (Extrato Seco) E GRAU DE ATENUAÇÃO REAL O etanol tem uma densidade de 0,79 g/cm 3 a 20°C, por isso, a sua presença na cerveja reduz a gravidade específica da mesma em relação ao mosto; O Extrato Real, em grau Plato, é a quantidade de açúcar que foi convertido em álcool durante a fermentação, desconsiderando o efeito do álcool, onde o Extrato Real (ER), pode ser estimado, conhecendo-se a concentração alcoólica da cerveja; Conhecendo o Extrato Real, pode se determinar o Grau de Atenuação Real da cerveja

47  GRAU DE REDU Ç ÃO: n ú mero de moles de eltrons dispon í veis por á tomo grama de carbono para serem transferidos para o oxigênio Considera-se H, como unidade de potencial de redox; (C, O, N, S, P) = (+4, -2, -3, 6, 5) Define-se um composto neutro para cada elemento: Carbono: (CO 2 ) Oxigênio: (H 2 O) Nitrogênio:(NH 3 ) Enxofre: H 2 SO 4 Fósforo: H 3 PO 4 O grau de redução da fonte de carbono do substrato, da biomassa e do produto pode ser calculado por: y s =(4w+x-2y-3z)/w y b =4+j-2k-3l y p =(4m+p-2q-3r)/m

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52 CarboidratoPorcentagem Maltotriose (C 18 H 32 O 16 )18 Maltose (C 12 H 22 O 11 )55 Glicose (C 6 H 12 O 6 )15 Sacarose (C 12 H 22 O 11 ) 2 Frutose (C 6 H 12 O 6 ) 2 Considere um mosto de malte com a seguinte composição: Determinar o fator de conversão máximo para cada carboidrato e a eficiência do processo.

53 É um fenômeno, que acontece pela aderência de uma levedura a outra, formando flocos, que afundam para o fundo do tanque ou deslocam para a superfície; A capacidade da levedura flocular é uma propriedade específica de uma levedura, dependente da parede celular; A floculação é determinada intrínsicamente pelas propriedades da parede celular de acordo com o comportamento do meio fermentativo;

54 ÁCIDOS ORGÂNICOS; citratos, succinatos, contribuem com acidez da cerveja; Lactato, hidroxiglutarato, ácido succínico e ácido málico; Os níveis destes composto, dependem da cepas de leveduras; Ácido acético, aparecem por contaminações. DICENTONAS VICINAIS; Ésteres; Álcoois superiores; Compostos sulfurados

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56 A formação de acetohidroxiácidos na cerveja, depende da cepa de levedura e aumentam quando aumenta o crescimento celular; As células não assimilam estes acetohidroxiácidos, mas os reduzem rapidamente em diacetil e 2,3 pentanodiona; Sistema enzimático dentro da célula, reduz o diacetil em composto menos agressivo organolépticamente, como o 2,3 butanodiona; Estes compostos são formados por contaminação bacteriana; Excesso de aeração Deficiência de valina, ou mosto com pouco malte; Leveduras defeituosas ou mutantes com baixa capacidade de redução; Sistema enzimático dentro da célula, reduz o diacetil em composto menos agressivo organolépticamente, como o 2,3 butanodiona; Cervejarias de todo o mundo, tomam o baixo teor de diacetil, como parâmetro de qualidade da cerveja

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58 Elevada temperatura; Elevado nível de aminoácidos; Agitação contínua; Crescimento elevado de levedura; Alta concentração alcoólica

59 São os compostos aromáticos mais importante da cerveja; Se formam pela esterificação dos álcoois e ácidos graxos, produtos do metabolismo da levedura; Ao reagir entre ambos produzem um ester de cadeias laterais R1 e R2; A biossíntese de ésteres pela levedura, é resultado da união de 1 acetilCoA, com 1 álcool formado na fermentação;

60 Formado pela reação de etanol, com Acil predominante da célula, o acetil-CoA

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