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Sendo tão pequenas, conseguirão fazer mal a alguém? As Cianocientistas, Bárbara Oliveira e Filipa Vaz Professor responsável José Luis Silva, Colégio Nossa.

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1 Sendo tão pequenas, conseguirão fazer mal a alguém? As Cianocientistas, Bárbara Oliveira e Filipa Vaz Professor responsável José Luis Silva, Colégio Nossa Senhora da Graça DATA: 06/03/2009 Clube da Ciência

2 O objectivo das várias experiências realizadas foi determinar o impacto que as toxinas de cianobactérias têm ao nível dos ecossistemas, realizando assim culturas e ensaios de toxicidade em laboratório. Basicamente criou-se um tipo de ambiente pretendido para poder estudá-lo e avaliar as consequências caso ocorre-se em situação real, ou seja, caso um bloom de cianobactérias preenchesse as águas utilizadas por todos os outros seres vivos.

3 As cianobactérias, Microcystis aeruginosa, são microrganismos autotróficos, a fotossíntese é o seu principal meio para obtenção de energia e manutenção metabólica. Os seus processos vitais requerem somente água, dióxido de carbono, substâncias inorgânicas e luz. Desenvolvem-se em águas poluídas e já tomaram conta de grande parte das fontes de água superficiais em Portugal, alastrando-se um pouco por todo o mundo. As cianobactérias modificam a qualidade da água produzindo toxinas, odores ou uma espuma densa de cor verde-azulada na superfície da água, chamada floração. Estas podem provocar graves problemas de saúde. Estas algas são propicías em ambientes com temperaturas elevadas. O aquecimento global é, portanto, um factor que pode levar ao aparecimento de blooms de cianobactérias. A chlorella é uma alga unicelular, microscópica, de água doce, muito rica em minerais, aminoácidos e compostos químicos orgânicos desintoxicantes. Constituí a base dos ecossistemas. Sob favoráveis condições de crescimento (forte luz solar, água pura e ar limpo) Chlorella p. multiplica-se a uma inacreditável taxa. As artémias são pequenos crustáceos da ordem Anostraca, de tamanho e coloração variadas, dependendo do tipo de alimento que elas consumirem. Vivem em regiões de água salgada concentrada (Salinas) - ambiente extremo no qual poucas espécies desenvolvem-se, de forma que há poucos predadores - por serem ricas em proteínas, vitaminas e sais minerais, é um dos melhores alimentos vivos que pode se fornecer aos peixes. Acelera a recuperação de doenças e os seus náuplios são indispensável à alimentação de alguns seres marinhos.

4 Foram realizados todos os protocolos fornecidos e o material indicado nos mesmos. A única alteração feita foi, ao lado da curva de crescimento da Microsystis aeruginosa, fez-se também uma curva de crescimento para a Chlorella vulgaris. Essa última curva de crescimento foi feita porque inicialmente o protocolo era um que continha um passo falacioso e, devido a uma má preparação e falta de leitura prévia, não se apercebemos que iria ser necessário meio Z8 no teste de toxicidade, ficando portanto sem meio. Utilizado no teste de toxicidade foi um filtrado do inoculo das algas verdes, devido à falta de material (meio Z8). Para tal esperou-se que as algas verdes assentassem na base do balão de fundo plano e retirou-se amostras da superfície da cultura. Essas amostras foram filtradas entre quatro a cinco vezes, tentando obter o conteúdo mais semelhante possível ao meio fornecido inicialmente. É claro que não continha os nutrientes na sua totalidade, podendo pois afectar os resultados do teste.

5 O gráfico obtido da curva de crescimento da Microcystis aeruginosa é:

6 Segundo a informação complementar fornecida, temos que a curva de crescimento contempla cinco fases: a fase de latência (fase Lag), uma fase relativamente curta, caracterizada por não ocorrer crescimento; a fase exponencial (fase Exp), uma fase em que ocorre aumento constante do número de organismos na cultura; a fase de desaceleração, uma fase em que ocorre um declínio no crescimento da cultura; a fase estacionária, caracterizada pela ausência de crescimento; e, por fim, a fase de morte, que ocorre quando o metabolismo celular já não pode ser mantido. Analisando a nossa curva de crescimento, temos que… Inicialmente, até ao quinto dia a concentração de cianobactérias manteve-se praticamente constante, não ocorrendo crescimento significativo (fase Lag). Do quinto ao vigésimo sexto dia, no geral, houve aumento constante da concentração celular [(fase Exp), com algumas excepções em que a concentração aumenta brutalmente. Tal facto pode dever-se à variação da temperatura que às vezes era mais elevada]. Do dia vinte e sete ao dia vinte e nove houve um declínio significativo na concentração de células da cultura (fase de desaceleração). De seguida observou-se uma fase mais estável em que o crescimento foi muito pouco acentuado, e que, comparado com o constante aumento visto anteriormente,não é minimamente significativo (fase estacionária). A partir do trigésimo sexto dia há uma quebra na concentração celular, que, apesar de a experiência ter acabo antes de acontecer, continuaria a diminuir (fase de morte).

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8 Devido ao facto de ter havido um erro na entrega do protocolo, ao distribuir o meio Z8, não foi deixado nenhum de parte para os ensaios de toxicidade, portanto, realizou-se uma curva de crescimento para a Chlorella vulgaris, tal como realizámos para as cianobactérias. Durante os primeiros sete dias a concentração das algas verdes manteve-se mais ou menos constante, não ocorrendo crescimento minimamente significativo (fase Lag). De dia sete a dia vinte e nove houve aumento significativo [(fase Exp), há muitas variações, altos e baixos, muito possivelmente devido a diferenças de temperatura]. De dia vinte e nove a dia trinta a concentração sofreu uma quebra acentuada (fase de desaceleração). Por fim, desde esse momento até ao dia trinta e sete(final das contagens) a concentração volta a aumentar. As restantes fases não foram observáveis durante a realização da cultura.

9 Algas verdes O ensaio de toxicidade das algas verdes foi realizado, mas, os resultados obtidos não foram os esperados. Ora vejamos Após a contagem obtivemos as seguintes concentrações Poço: A 1 – 5,44 x10 6 cél/mL A 2 – 2,335 x10 6 cél/mL A 3 – 2,235 x10 6 cél/mL A 4 – 2,155 x10 6 cél/mL Onde há maior concentração de cianobactérias é onde há mais células e, onde era suposto haver mais células, que era no controlo, é onde existem menos. E isso verifica-se para as restantes réplicas. B 1 – 3,82 x10 6 cél/mL B 2 – 2,285 x10 6 cél/mL B 3 – 2,55 x10 6 cél/mL B 4 – 2,03 x10 6 cél/mL No B 3 notasse um ligeiro aumento, mas não é significativo, e no B 4 volta a diminuir. C 1 – 2,91 x10 6 cél/mL C 2 – 2,26 x10 6 cél/mL C 3 – 2,225 x10 6 cél/mL C 4 – 2,045 x10 6 cél/mL Para a 3ª réplica, as mesmas conclusões…

10 É-nos pedido para calcular a % de inibição de crescimento da Chlorella fazendo O problema é que o valor médio do controlo é sempre o mais pequeno, e era suposto ser o maior… O que nos vai dar erro nos cálculos todos.

11 Também temos que, no dia em que se iniciou o ensaio de toxicidade da Chlorella, a concentração era de 9,21 × 10 6 cél/mL. Como isto também não foi feito totalmente como devia, temos que: O protocolo diz que devíamos ter feito uma diluição com meio Z8, para que a concentração inicial fosse de 1 × 10 6 cél/mL. Nós não o conseguimos fazer porque não tínhamos o meio Z8 (mandaram-nos o protocolo errado e nós gastámos o meio todo logo para as culturas de cianobactérias e de chlorella e, quando mandaram o protocolo certo, nós ficámos com o problema de já não termos o meio). Assim em vez de 1 × 10 6 cél/mL, ficámos com uma concentração inicial de 9,21 × 10 6 cél/mL (o que é uma concentração muito elevada para o pouco de cianobactérias que os poços tinham).

12 O protocolo também dizia que, durante o teste de toxicidade, as células deveriam estar em constante agitação ou, pelo menos, serem agitadas três vezes ao dia, o que não aconteceu por falta de disponibilidade de ir ao laboratório. Foram só agitadas 2 vezes por dia. Mas também não há-de ter sido esse o problema. Outra coisa, e essa deve ter sido a principal razão para o teste não ter dado bem, foi altura em que o realizámos. Este teste era para ter sido realizado logo após ter recebido o material, o que não aconteceu. O teste foi realizado 41 dias depois, o que é uma GRANDE diferença. A culpa disto foi a falta de preparação prévia da experiência, a falta de tempo e disponibilidade para realizar o teste de toxicidade e o facto de nos terem enviado o protocolo errado. Uma das coisas que salientavam logo no inicio era que este material se poderia estragar, por isso, pode ter-se dado o caso do extracto congelado das cianobactérias já não ter sido viável para utilização no teste, alterando os resultados (o mesmo para as artemias, pesar de eles terem dito que o ensaio de toxicidade das artemias podia ser feito em qualquer altura). Tendo em conta também a baixa temperatura em que a experiência decorreu, rondou em média os 17/18°C, enquanto deveria estar a uma temperatura de 25°C.

13 Gráfico da percentagem de mortalidade em função da concentração de solução tóxica de Microcystis

14 Supostamente, o ensaio onde houvesse menos concentração de cianobactérias, seria aquele onde haveria menos percentagem de náuplios mortos, mas como podemos verificar tal não acontece. Na amostra A, para níveis mais baixos de concentração de cianobactérias temos maior percentagem de mortos. E, há medida que a concentração vai aumentando, a percentagem de mortos vai diminuindo. Isso leva a que todos os valores calculados de inibição sejam superiores a 100%. Teoricamente seria de esperar precisamente o contrário. O mesmo acontece nas restantes réplicas. Este resultados podem ter-se devido ao facto de: O obtenção dos náuplios ter sido iniciada a uma terça e ter sido esperado um período de 48h para eclodirem (pois a temperatura estava muito baixa por volta dos 17ºC), e por falta de disponibilidade o ensaio ter sido deixado para fazer na segunda-feira da semana a seguir. O problema é que, durante esse tempo todo, os náuplios foram deixados sem alimento, e isso e influenciou, sem dúvida, os resultados obtidos.

15 E se um bloom de cianobactérias te batesse à porta? É esta a grande questão, que através dos resultados obtidos durante este tempo de realização de testes, vamos tentar dar resposta. Através das experiências realizadas, e apesar dos erros obtidos, podemos concluir que, as cianobactérias vivem dependentes de dois factores, a luz e a temperatura, e que estas bactérias fotossintéticas são beneficiados onde as temperaturas são mais elevadas e crescem de maneira rápida em condicões favoráveis. O consequente aumento da temperatura global, pode vir a ter graves problemas a nível dos ecossistemas marinhos, pois estas algas, devido a um crescimento mais acalerado, podem passar a ser muito mais frequentes em zonas de temperaturas mais elevadas. Um bloom de cianobactérias, traria a morte aos oceanos, isto porque, estas algas concentram-se em grande número, cobrindo toda a superficie de uma determinada zona, impossibilitando a passagem de luz solar para todos os seres vivos que vivem lá.

16 Logo aí, trazem problemas para os outros seres vivos e, mais ainda, através dos ensaios de toxicidade, e com a base teórica, sabemos que, elas afectariam seres, como a Chlorella e os náuplios de Artémia, pelo qual estes são seres vivos que se encontram na base das cadeias alimentares. Visto que as cianobactérias libertam toxinas, irão prejudicar o crescimento destas espécies e até conduzir à sua morte. Provocando assim um decréscimo na diversidade das espécies. Para além disso, as toxinas libertadas afectam a saúde humana, sendo que a água contaminada se torna imprópria para utilização, uma vez que quando em contacto com os seres humanos podem provocar morte imediata. Independentemente dos resultados obtidos a actividade foi muito enriquecedora para nós e agora é que nos sentíamos preparadas para a fazer de raiz.


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