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CLAUDIA MARIA MEIRELLES MARCHINI. Genoma É a informação genética pertencente a uma célula ou um organismo Genoma humano apresenta aproximadamente 25 mil.

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1 CLAUDIA MARIA MEIRELLES MARCHINI

2 Genoma É a informação genética pertencente a uma célula ou um organismo Genoma humano apresenta aproximadamente 25 mil genes

3 Projeto Genoma humano Mapeamento do genoma humano Identificação dos nucleotídeos Aproximadamente 1,5% do genoma codificam proteínas Seqüências genoma que não codificam proteínas consistem RNA, seqüências regulatórias, íntrons e junk DNA

4 Ômicas: novas ciências * Genoma * Transcriptoma * Proteoma * Metaboloma * Nutrogenoma * Lipidoma Outras Ômicas…

5 Interação Nutriente – Gene Objetivo: estabelecer dietas personalizadas com base no genótipo para promover a saúde diminuindo os riscos de doenças crônicas (cardiovasculares, diabetes, câncer...) É fundamental a aplicação na área da nutrição das ferramentas da genômica funcional para a análise do transcritoma, do proteoma e do metaboloma. Aplicabilidades: cultura de células, modelos experimentais em animais, estudos pré-clínicos e clínicos

6 Ciências Nutricionais Galactosemia é um defeito genético na enzima GALT, levando a um acúmulo de galactose no sangue Fenilcetonúria é um defeito genético na enzima fenilalanina- hidrolase, levando a um acúmulo de fenilalanina Deficiências de vitaminas como a B12, ácido fólico, B6, C, E, ferro ou zinco causam dano no DNA quebrando a dupla-fita A deficiência de nutrientes pode explicar porque ¼ da população dos Estados Unidos que não consome as 5 porções diárias recomemdadas de vegetais e frutas tem um risco 2 X maior de desenvolverem câncer

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8 Nutrigenômica Caracteriza uma nova visão do estudo de alimentos e da pesquisa nutricional na qual a avançada tecnologia funcional genômica é usada, ao lado de técnicas nutricionais e bioquímicas, para determinarem os mecanismos pelos quais os alimentos e seus componentes individuais modulam processos que ocorrem nos tecidos do corpo humano. Instituto de Pesquisa de Alimentos, 2001

9 Abordagem molecular: Estudo entre as interações dos nutrientes com os genes e o efeito na saúde do indivíduo

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11 Nutrientes atuam em transdução de sinal Chá verde Polifenol 11-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) Inibe NF-kappaB fator de transcrição

12 Porque individuais respondem de forma diferenciada a uma dieta especifica? Variabilidade genética!

13 Antes * Durante as cercas de mitoses possíveis durante uma vida humana, em cada LOCUS podem ocorrer 10 8 a mutações Mutações Antes Depois Luz ultra-violeta

14 Mutações * Alteração permanente e transmissível na seqüência de nucleotídeos em um gene que pode causar a alteração ou a perda da função normal. | | | | | | | | | A T C G T A C G G T A G C A T G C C T A G C C T G C C T A G C A T G C C A T C G T A C G G A T C G G A C G G T A G C C T G C C A T C G T A C G G U A G C C U G C CU A G C A U G C C Transcrição Replicação RNA: A T C G T A C G G Proteína:

15 Tipos de Mutação Sem Sentido TAC CAC GTG ATA AUG GUG CAC UAU MET VAL HIS TYR TAC CCC GTG ATT AUG GGG CAC UAA MET GLY HIS STOP... !

16 Tipos de Mutação Sentido Trocado TAC CAC GTG CAC AUG GUG CAC GUG MET VAL HIS LEU TAC CCC GTG CAC AUG GGG CAC GUG MET GLY HIS LEU

17 A estrutura da proteína permite que sua função seja executada. Alteração em sua estrutura afetará sua especificidade ou atividade.

18 Radiação Ionizante * Formação de dímeros de Pirimidina * Interrupção da replicação * Seqüências truncadas Modificações das Bases Nitrogenadas

19 Mutagênicos Químicos * Alguns mutagênicos químicos modificam a estrutura molecular das bases. * No caso dos agentes alquilantes, são adicionados grupos etil ou grupos metil

20 Mutagênicos Químicos Ferguson & Philpott. The annual Review of Nutrition, 28: , Structures of dietary mutagens

21 Aflatoxina B1 * Produzida pelo fungo Aspergillus flavus

22 Aflatoxina B1 * Populações expostas a esta molécula tem alto índice de hepatocarcinoma * 50% dos casos de hepatocarcinoma apresentam mutação no gene p53 GC TA Transversão

23 Polimorfismo Single Nucleotide Polymorphism (SNP) * Variação em uma seqüência de DNA em um único nucleotídeo * Deve ocorrer em ao menos 1% da população

24 Como são detectadas as diferenças entre os indivíduos? O brócolis possui algum efeito na expressão genética na dieta? Experimento por um mês utilizando a Dieta A (enriquecida por Brócolis) e Dieta B (ausência de Brócolis outras hortaliças semelhantes) Sujeitos: gêmeos idênticos saudáveis

25 Microarranjo DNA microarray, DNA chip, genome chip, expression chip e gene array São vendidos comercialmente por empresas de biotecnologia Aproximadamente pontos/cm2

26 DNA Microarray Cada ponto representa um gene distinto

27 Extração RNA O RNA é separado com auxílio de uma centrífuga, a velocidade alta separa os componentes da solução dependendo do tamanho ou densidade RNA Proteína, DNA e outros componentes

28 RNA total RNA mensageiro RNA transportador RNA ribossômico

29 Isolamento do mRNA Colunas contendo pequenas esferas recobertas por poli-T que se ligam somente com mRNA que possuem cauda poli-A Pequenas esferas constituem a coluna Aumento de uma esfera

30 Retenção do mRNA na coluna As fitas de mRNA ficaram retidas nas esferas poli-T por meio das caudas poli-A

31 Recuperação do mRNA Como liberar o mRNA das esferas? – O pareamento de bases entre moléculas de DNA é comprometido por concentrações de sais e pH

32 Produção de uma cópia de cDNA fluorescente Montagem de uma fita complementar de DNA oposta a molécula de mRNA Solução Fluoresncente verde Solução fluorescente vermelha Dieta BDieta A

33 Conteúdo da solução fluorescente Primers Poli-T: unem-se as cadeias poli-A dos mRNA Transcriptase reversa: uma enzima que sintetiza a fita de cDNA Nucleotídeos fluorescentes: serão incorporados na nova molécula de cDNA

34 Aplicação do cDNAs marcados com fluorescência Transcriptase reversa produz cDNA fluorescente e moléculas de mRNA foram degradadas com RNAses

35 cDNAs vermelhos hibridaram com este ponto cDNAs verdes hibridaram com este ponto cDNAs que não hibridaram cDNAs vermelhos e verdes hibridaram Com este ponto

36 Leitura da placa de microarray O scanner lê um fluoróforo por vez; O programa faz uma sobreposição das imagens; O importante são os pontos verdes e vermelhos isolados

37 Exemplo de aplicação do microarray Uma linhagem celular de carcinoma de cólon foi tratada com sulforafona Composto bioativo de brócolis Resultado: Indução da expressão do 106 genes Inibição da expressão de 63 genes – Atividade anticarcinogênica

38 Limitações Necessidade de quantidades significativas de tecido para o isolamento de mRNA. Necessidade de repetições para obter valor significativo Alto custo da técnica O tratamento com nutrientes específicos promovem, geralmente, pequenas alterações na expressão gênica, dificultando a análise dos resultados Baixa reprodutibilidade utilizando-se plataformas de diferentes fabricantes

39 Doença inflamatória intestinal (IBD) Inflamação crônica do trato gastrointestinal – Colite ulcerativa (UC) – Doença de Crohn (CD) Sintomas: diarréia, cólica abdominal, febre e sangramento Tratamento: remédios que controlam os sintomas, mas não curam a doença; dieta controlada

40 Doença inflamatória intestinal (IBD)

41 Genes envolvidos no estabelecimento da IBD Reconhecimento de bactérias Na modulação da resposta inflamatória No transporte de moléculas na mucosa intestinal

42 Proteína NOD2 Proteção contra bactérias invasivas I) Genes envolvidos no reconhecimento de bactérias

43 Afetam Resposta Imune Autoimunidade II) Genes envolvidos na modulação da resposta imunológica

44 Transdução de Sinal Intracelular III) Genes envolvidos no transporte de moléculas na mucosa intestinal

45 Dieta na doença inflamatória intestinal A IBD pode ser controlada com uma dieta elemental, que parece modular a ação de citocinas e mudar a microbiota do intestino Desafios: não existe um grupo de alimentos que seja benéficos ou causem danos a todos os pacientes. A dieta de eliminação é usada para se verificar as necessidades individuais

46 Perspectivas IBD Omega-3 pode reduzir os sintomas da inflamação; Chá verde pode regular a expressão de proteínas transportadoras Porém o gene de interesse deve estar funcionando normalmente no paciente A identificação dos genes levam ao desenvolvimento da doença e assim permitir uma abordagem mais específica Dietas específicas poderiam aliviar os sintomas e curar até 90% dos pacientes

47 Concluindo Nutrientes alteram processos moleculares, expressão genética e metabolismo Variações genéticas individuais podem influenciar como os nutrientes são assimilados Ferramentas moleculares estão sendo empregadas para examinar a resposta individual aos nutrientes A nutrigenômica irá desenvolver dietas personalizadas para prevenir o surgimento de doenças e manter a saúde humana

48 OBRIGADA PELA ATENÇÃO


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