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Expressão Gênica em Oócitos e Embriões Priscila M. M. de Leon Doutoranda PPGB Novembro, 2010 Universidade Federal de Pelotas Graduação em Biotecnologia.

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1 Expressão Gênica em Oócitos e Embriões Priscila M. M. de Leon Doutoranda PPGB Novembro, 2010 Universidade Federal de Pelotas Graduação em Biotecnologia Disciplina de Manipulação de Gametas e Embriões

2 Análise de Expressão Gênica Análise do mRNA e de proteínas em oócitos e embriões Conceito:

3 Ferramenta importante na evolução de biotecnologias da reprodução assistida; mRNA: Diferença de expressão in vivo e in vitro; Envolvidos no desenvolvimento inicial embrionário; Apoptose: principal fator que afeta o potencial de desenvolvimento embrionário; Análise da Expressão Gênica:

4 Análise de Expressão Gênica Obtenção de Marcadores Moleculares; Identificação de genes envolvidos na Maturação oocitária; Identificação de genes envolvidos no Desenvolvimento Embrionário; Marcadores de sobrevivência e imalntação embrionária; Diferenças na expressão gênica IN VIVO e IN VITRO; Resistência ou suscetibilidade a Criopreservação; Objetivos:

5 Maturação in vitro Insucesso da FIV Cultivo in vitro embrionário Danos na Criopreservação de Oócitos Implantação embrionária Desafios da PIV de Embriões:

6 Metodologia empregada na Avaliação da Expressão Gênica

7 Qualidade do oócito: » Qtidade de camadas do cumulus; » Integridade do citoplasma e zona pelúcida; Expansão das células do cumulus: » % Total e % parcial; Maturação nuclear e integridade de membrana: » % MII e coloração IP e DF; Clivagem e desenvolvimento embrionário: » Clivagem em 24 h, avaliação a cada 48 h; Viabilidade embrionária » Coloração IP e DF; Avaliações:

8 Análise da Expressão Gênica: » Extração RNA total: reagente TRIzol® (Invitrogen, USA); » Quantificação e padronização do RNA; » Sintese do cDNA: kit High Capacity cDNA Reverse Transcription® (Applied Biosystems, USA); » Primers específicos (H2a, Telomerase, Caspase 3, Bcl-2, BAX, Hsp 70, STAT-1, p 53, calpaína e catepsina); » Avaliação da expressão: qRT-PCR (PCR quantitativa em Tempo Real); » Gene normalizador: GAPDH e beta-actina;

9 Apoptose: H2a; Telomerase; Caspase 3; Bcl-2; BAX; Hsp 70; STAT-1; p 53; Calpaína; Catepsina.

10 Aplicações Análise de Expressão Gênica: Qualidade de Oócitos e Embriões: – Avaliação morfológica têm sido utilizada como critério para selecionar Oócitos e Embriões de melhor qualidade (Grau 1 a 5); – no entanto, a morfologia é insuficiente na avaliação do desenvolvimento embrionário – não permitindo distinguir oócitos competentes que têm a habilidade de levar uma gestação à termo Necessidade de uma seleção mais precisa que reflita a Competência Oocitária e embrionária.... Estudos de expressão gênica associados à competência elucidando os mecanismos genéticos e bioquímicos envolvidos na sobrevivência; melhores resultados obtidos na reprodução assistida

11 A caracterização molecular é importante: – na elucidação dos mecanismos necessários para que o oócito adquira competência – Identificação de marcadores moleculares relacionados com a capacidade de desenvolvimento. A abordagem utilizada na investigação desses mecanismos é a comparação de ovócitos com diferentes graus de competência.

12 Competência Oocitária: Definida como a habilidade ou potencial de um oócito passar pela maturação, ser fecundado, desenvolver até o estágio de blastocisto e ter a capacidade de induzir uma gestação é progressivamente adquirida durante os estágios finais da foliculogênese, por várias alterações celulares e moleculares que proporcionam ao oócito capacidade para o desenvolvimento embrionário após a fecundação

13 Aplicações Análise de Expressão Gênica: Maturação de Oócitos: Genes que estão envolvidos na capacidade de maturação do oócito; Identificar os fatores que regulam a aquisição da competência durante o processo de maturação; Esse conhecimento é fundamental para indicar as alterações necessárias para que o sistema in vitro possa ser o mais semelhante possível do in vivo, e com isso aumentar a disponibilidade de oócitos de melhor qualidade para serem utilizados

14 Maturação Oocitária: A maturação se refere ao estágio final de preparação do oócito para ser fecundado, e envolve modificações nucleares e citoplasmáticas. A maioria dos oócitos recuperados a partir de folículos antrais é capaz de completar a maturação nuclear, mas apenas os competentes são capazes de ter desenvolvimento embrionário normal. Nem todos que completam a maturação nuclear têm a capacidade de se desenvolver até o estágio de blastocisto. Essa diferença pode ser atribuída ao status de maturação citoplasmática e molecular que difere entre os competentes e incompetentes

15 Maturação Oocitária: 8000 genes estão sendo expressos em oócitos bovinos; Destes 821 são relacionados a maturação; Genes de origem materna tem sido foco devido seu papel no desenvolvimento embrionário; Um aspecto importante durante o crescimento do oócito é seu alto grau de atividade transcricional; portanto, mudanças moleculares podem ser responsáveis pelo aumento na competência dos ovócitos; Os eventos moleculares se referem a essas modificações, que envolvem síntese, degradação e alterações de RNAm e proteínas, favorecendo o oócito com o estoque molecular necessário para a fecundação e os eventos posteriores (clivagem, desenvolvimento e implantação) 8000 genes estão sendo expressos em oócitos bovinos; Destes 821 são relacionados a maturação; Genes de origem materna tem sido foco devido seu papel no desenvolvimento embrionário; Um aspecto importante durante o crescimento do oócito é seu alto grau de atividade transcricional; portanto, mudanças moleculares podem ser responsáveis pelo aumento na competência dos ovócitos; Os eventos moleculares se referem a essas modificações, que envolvem síntese, degradação e alterações de RNAm e proteínas, favorecendo o oócito com o estoque molecular necessário para a fecundação e os eventos posteriores (clivagem, desenvolvimento e implantação)

16 Oócitos possuem RNAm e proteínas necessárias ao primeiro estágio do desenvolvimento embrionário: – sendo que qualidade e quantidade de transcritos podem estar associadas ao potencial do oócito em desenvolver um embrião – os ovócitos de mamíferos possuem a necessidade de acumular todos os fatores maternos necessários para os eventos pós- fecundação Os resultados mostraram que a classificação morfológica de COCs pode separar oócitos com alto e baixo potencial de desenvolvimento antes da MIV: – Oócitos com alto potencial de desenvolvimento possuem, em geral, maior quantidade de mRNA que foram estocados durante o crescimento do ovócito e fase final da foliculogênese – Oócitos com baixo potencial de desenvolvimento possuem menor quantidade de mRNA Oócitos possuem RNAm e proteínas necessárias ao primeiro estágio do desenvolvimento embrionário: – sendo que qualidade e quantidade de transcritos podem estar associadas ao potencial do oócito em desenvolver um embrião – os ovócitos de mamíferos possuem a necessidade de acumular todos os fatores maternos necessários para os eventos pós- fecundação Os resultados mostraram que a classificação morfológica de COCs pode separar oócitos com alto e baixo potencial de desenvolvimento antes da MIV: – Oócitos com alto potencial de desenvolvimento possuem, em geral, maior quantidade de mRNA que foram estocados durante o crescimento do ovócito e fase final da foliculogênese – Oócitos com baixo potencial de desenvolvimento possuem menor quantidade de mRNA

17 Atividade Transcricional: Período de crescimento do oócito: oócito possui alto grau de atividade transcricional; Período de Maturação oócito: a transcrição diminui marcadamente antes da maturação do oócito. Em bovinos é quando o folículo possui 3 mm; A partir deste ponto a transcrição continua em nível bem menor, sugerindo que as proteínas e transcritos que foram estocados não são substituídos, pelo contrário, são gradualmente traduzidos ou degradados até o momento da ativação do genoma embrionário, de forma a suprir as necessidades da fecundação e desenvolvimento embrionário inicial. Período de crescimento do oócito: oócito possui alto grau de atividade transcricional; Período de Maturação oócito: a transcrição diminui marcadamente antes da maturação do oócito. Em bovinos é quando o folículo possui 3 mm; A partir deste ponto a transcrição continua em nível bem menor, sugerindo que as proteínas e transcritos que foram estocados não são substituídos, pelo contrário, são gradualmente traduzidos ou degradados até o momento da ativação do genoma embrionário, de forma a suprir as necessidades da fecundação e desenvolvimento embrionário inicial.

18 Transcrição na maturação: comparado com o oócito não maturado, após a MIV a quantidade de RNAm foi reduzida em 69% (em oócitos bovinos) Clivagem: diminuindo para 10% o nível de transcrição em embriões de 2 células. Desenvolvimento embrionário: um aumento de 4 vezes no nível de transcrição foi observado em embriões de 4 células. Uma nova redução na quantidade de mRNA é evidenciada em embriões de 8 células e blastocistos Novo aumento no nível de transcrição em estágios de blastocistos eclodidos, é observado 9 vezes mais atividade. Transcrição na maturação: comparado com o oócito não maturado, após a MIV a quantidade de RNAm foi reduzida em 69% (em oócitos bovinos) Clivagem: diminuindo para 10% o nível de transcrição em embriões de 2 células. Desenvolvimento embrionário: um aumento de 4 vezes no nível de transcrição foi observado em embriões de 4 células. Uma nova redução na quantidade de mRNA é evidenciada em embriões de 8 células e blastocistos Novo aumento no nível de transcrição em estágios de blastocistos eclodidos, é observado 9 vezes mais atividade.

19 Tremoleda et al., Crescimento.: Transcrição Maturação.: Transcrição (redução em 69%)

20 2 céls.: 10% Blastocisto: transcrição 4 céls.: 4x 8 céls.: transcrição Blastocisto Eclodido: 9x

21 Discussão de Artigo


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