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Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS Determinação da Estrutura tri-dimensional de Proteínas utilizando difração.

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1 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS Determinação da Estrutura tri-dimensional de Proteínas utilizando difração de Raios-X

2 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br O processo completo consiste em produzir cristais de proteínas (>0.1 mm na sua menor dimensão), nos quais as moléculas estejam razoavelmente bem ordenadas para que o feixe de raios-X incidente sobre esse cristal seja difratado gerando um padrão de reflexões que, através da análise dos dados cristalográficos, produzam um mapa tri-dimensional de densidade eletrônica da molécula. Um modelo da proteína com sequência conhecida deve então ser modelado neste mapa. CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS

3 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br POR QUE RAIOS-X ? Adaptado de O uso de radiação eletromagnética para visualizar objetos requer que a radiação tenha um comprimento de onda comparável às menores características que desejamos resolver. Os raios-X tem um comprimento de onda de 1.54Å. Este valor é próximo à distância entre átomos de carbono numa ligação peptídica, sendo então ideal para estudar estruturas de proteínas.

4 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br Incidir Raios-X sobre uma única molécula resultaria num sinal extremamente fraco que nunca poderia ser detectado acima do nível de barulho, gerado pelo espalhamento da água e do ar. Um cristal arranja um número grande de moléculas na mesma orientação, então as ondas espalhadas podem ser adicionadas em fase aumentando o sinal a um nível que possa ser medido. O cristal atua como um amplificador. POR QUE CRISTAIS?

5 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br Uma gota é formada misturando-se volumes iguais de solução de proteína e de uma solução precipitante. gota contendo proteína e precipitante Inicialmente a concentração de precipitante na gota é metade da sua concentração no poço. Um volume bem maior de precipitante é colocado em um reservatório abaixo da gota. Método de difusão de vapor com a gota sentada

6 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br GP120 - uma glicoproteína do envelope exterior do vírus HIVtipo 1 Universidade de Columbia Proteína que liga quitina Tjaard Pijning RU Groninger Lisozima Eddie Snell NASA Dihidrolipoamida desidrogenase Tassie & Roeber NASA Biliverdina-IX redustase complexada com NADP Rosa Perez-Luque IBMB-CSIC Barcelona Exemplos de cristais de proteínas já estudados TIM Aparício LNLS

7 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br Raios-X e Cristais de Proteínas O Experimento : Uma vez obtido, o cristal da proteína é irradiado com Raios-X Placa de Imagem Espelhos para focalizar o feixe de raios-x Os raios-X são difratados pelo cristal

8 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br Padrão de Difração de Raios-X A organização dos pontos no padrão está relacionada com a distribuição de moléculas no cristal; Diferenças de intensidade relacionam-se com a distribuição dos átomos na molécula. O espalhamento do feixe de raios-X pelo cristal produz o padrão de difração;

9 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br Mapa de densidade eletrônica O resultado do experimento não é a figura dos átomos, mas um mapa de distribuição dos elétrons na molécula, isto é, um mapa de densidade eletrônica. No entanto, uma vez que os elétrons são mais localizados ao redor do núcleo, o mapa de densidade eletrônica nos dá uma boa idéia da molécula.

10 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br Resolução Todos os modelos tem uma incerteza na posição dos átomos. Valores numéricos pequenos para resolução significam uma pequena incerteza, então resolução alta; valores altos significam uma grande incerteza, então resolução baixa. A resolução é medida em Ångstroms (Å). Está diretamente relacionada com a distância mínima a que dois objetos podem estar e ainda serem vistos como dois objetos. 7.0 Å é uma resolução baixa para proteína 3.0 Å é uma resolução média 1.6 Å é alta resolução Quebra na densidade eletrônica Posição do CO não está bem definida

11 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br Mapa de densidade eletrônica Átomos são inseridos na densidade para construir o modelo da proteína Ajustando o modelo na densidade eletrônica

12 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br Construção do modelo da proteína Uma vez obtido o mapa de densidade eletrônica, é necessário colocar a sequência de aminoácidos da proteína dentro da densidade para construir o modelo:

13 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br Uma vez obtida a estrutura tri-dimensional da proteína podemos utilizá-la para: entender seu funcionamento... Análise do modelo para estudo da função da proteína

14 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br … visualizar partes específicas de uma proteína como sítios de ligação de pequenas moléculas, para entender como a ligação acontece...

15 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br … verificar as distâncias interatômicas...

16 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br … fazer comparações entre estruturas de proteínas,...

17 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br Azul: cargas positivas … visualizar a distribuição de cargas na superfície da proteína, etc. Vermelho: cargas negativas

18 Paula Kuser Falcãohttp://www.cbi.cnpia.embrapa.br A informação estrutural é essencial para entender como as moléculas biológicas funcionam e fornece conhecimento para a obtenção de novos medicamentos para cura de doenças como AIDS, Câncer, anemia, diabetes, etc. HIV protease ligado a um inibidor


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