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CROMATOGRAFIA Histórico M. TSWEET (1903): Separación de diferentes pigmentos vegetales en columnas rellenadas con adsorventes sólidos y solventes variados.

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1 CROMATOGRAFIA Histórico M. TSWEET (1903): Separación de diferentes pigmentos vegetales en columnas rellenadas con adsorventes sólidos y solventes variados. éter de petróleo CaCO 3 mistura de pigmentos separados Cromatografia = kroma [color] + graph [escribir] (griego)

2 CROMATOGRAFIA Modalidades y Clasificación FM = Líquido FM = Gas Cromatografia Líquida Cromatografia Gasosa (CG) En CG a FE puede ser: Sólida Líquida Cromatografia Gas-Sólido (CGS) Cromatografia Gas-Líquido (CGL)

3 Cromatógrafo Gaseoso Reservorio de Gas y Controles de Vapor / Presión. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Columna Cromatográfica. 4 - Detector. 5 – Amplificador de Señal. 6 - Registro de Señal (Registrador con Computadora). Observación: en rojo: temperatura controlada

4 INSTRUMENTACIÓN Gas de Arraste Fase Móvil en CG: NO interacciona con la mues- GAS DE ARRASTE tra - apenas se desliza a través de la columna. Siendo usualmente referida como GAS DE ARRASTE Requisitos: INERTE No debe reaccionar con la muestra, fase estacionaria o superfícies del instrumento. PURO Debe ser exento de impurezas que puedan degradar la fase estacionaria. Impurezas típicas en gases y sus efectos: oxida / hidroliza algunas FE incompatibles con el DCE H 2 O, O 2 hidrocarbonetos ruído sin señal del DIC

5 INSTRUMENTACIÓN Gas de Arraste Requisitos: COSTO Gases de altísima pureza pueden ser muy caros. COMPATIBILIDAD CON EL DETECTOR Cada detector demanda um gas de arraste específico para mejor funcionamiento. Selección de Gases de Arraste en Función del Detector: He, H 2 DCT DIC N 2, H 2 DCE N 2 (SS), Ar + 5% CH 4 COSTO PUREZA A B C A = 99,995 % (4.5) B = 99,999 % (5.0) C = 99,9999 % (6.0)

6 INSTRUMENTACIÓN Alimentación del Gas de Arraste Componentes necesarios en la linea de gas: controladores de vapor / presión de gas dispositivos para purificación de gas (traps) Cilindro de Gas 2 - Regulador de Presión Primario 3 - Traps para eliminar impurezas del gas 4 - Regulador de Presión Secundario 5 - Regulador de Vapor (Controlador Diferencial de Flujo) 6 - Medidor de Vapor (Rotametro) Nota: Tubos y Conecciones: Acero Inox o Cobre

7 INSTRUMENTACIÓN Inyector en-columna Convencional Septo (silicona) 2 - Alimentación de gas de arraste 3 - Bloque metálico caliente 4 - Punta de columna cromatográfica

8 INSTRUMENTACIÓN Inyección en-columna de líquidos Punta de aguja de microjeringa introducida al inicio de la coluna. 2 – La muestra inyectada y vaporizada instantaneamente al inicio de la columna. 3 - Plug de vapor de mustra forzado para gas de arraste a fluir por la columna.

9 INSTRUMENTACIÓN Parametros de Inyección TEMPERATURA DE INYECTOR Debe ser sufi- cientemente elevada para que la muestra se vaporice imediatamente, sin descomposición Regla Gral: T inj = 50 o C encima de la temperatura de ebulición del componente menos volátil VOLUMEN INYECTADO Depende del tipo de columna y del estado físico de la muestra Columna empaq. muestras Gasosas muestras Líquidas = 3,2 mm ( 1 / 4 ) 0,1 ml mL 0,2 L L capilar = 0,25 mm 0,001 ml... 0,1 mL 0,01 L... 3 L Sólidos: convencionalmente se disuelve en un solvente adecuado y se inyecta la solución

10 INSTRUMENTACIÓN Microjeringas para Inyección LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L êmbolo cuerpo (pirex) aguja (inox 316) Microjeringa de 10 L: Microjeringa de 1 L (sección ampliada): cuerpo guia embolo aguja

11 INSTRUMENTACIÓN Colmunas: Definiciones Básicas EMPAQUETADA = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m Relleada con sólido pul- verizado (FE sólida o FE líquida depositada sobre las partículas de relleno) CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m Paredes internas recubier- tas con un film fino (fracción de m) de FE líquido o sólido

12 INSTRUMENTACIÓN Temperatura de la Columna TEMPERATURA DE LA COLUMNA CONTROL CONFIABLE DE LA TEMPERATURA DE LA COLUMNA ES ESENCIAL PARA OBTENER BUENA SEPARACIÓN EN CG

13 INSTRUMENTAÇÃO Forno da Coluna Características Desejáveis de um Forno: FÁCIL ACESSO À COLUNA A operação de troca de coluna pode ser frequente. AQUECIMENTO E ESFRIAMENTO RÁPIDO Importante tanto em análises de rotina e durante o desenvolvimento de metodologias analíticas novas. TEMPERATURA ESTÁVEL E REPRODUTÍVEL A temperatura deve ser mantida com exatidão e precisão de ± 0,1°C. Em cromatógrafos modernos (depois de 1980), o controle de temperatura do forno é totalmente operado por microprocessadores.

14 INSTRUMENTAÇÃO Programação Linear de Temperatura Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE: T COL BAIXA: - Componentes mais voláteis são separados - Componentes menos volá- teis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos T COL ALTA: - Componentes mais volá- teis não são separados - Componentes menos volá- teis eluem mais rapidamente

15 INSTRUMENTAÇÃO Programação Linear de Temperatura A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação: Consegue-se boa separação dos componentes da amostra em menor tempo TEMPO TEMPERATURA t INI t FIM T INI T FIM R Parâmetros de uma programação de temperatura: T INI Temperatura Inicial T FIM Temperatura Final t INI Tempo Isotérmico Inicial t FIM Tempo Final do Programa R Velocidade de Aquecimento

16 INSTRUMENTAÇÃO Programação Linear de Temperatura Possíveis problemas associados à PLT: VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura. viscosidadevazão DERIVA (DRIFT) NA LINHA DE BASE Devido ao aumento de volatilização de FE líquida

17 INSTRUMENTAÇÃO Detectores Dispositivos que examinam continuamente o material eluido, gerando sinal quando da pas- sagem de substâncias que não o gás de arraste Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.

18 INSTRUMENTAÇÃO Detectores Mais Importantes: DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS ( DCE OU ECD ) Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos. DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA ( DCT OU TCD ) Variação da condutividade térmica do gás de arraste. DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA ( DIC OU FID ) Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H 2 + ar. REGISTRO DE SINAL ANALÓGICO Registradores XY DIGITAL Integradores Computadores

19 FASES ESTACIONÁRIAS Conceitos Gerais LÍQUIDOS Depositados sobre a superfície de: só- lidos porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas capilares) FE líquida SUPORTE Sólido inerte poroso Tubo capilar de material inerte SÓLIDOS Colunas recheadas com material finamente granulado (empacotadas) ou depositado sobre a superfície interna do tubo (capilar) Para minimizar a perda de FE líquida por volatilização, normalmente ela é: Entrecruzada: as cadeias poliméricas são quimicamente ligadas entre si Quimicamente ligadas: as cadeias poliméricas são presas ao suporte por ligações químicas

20 FASES ESTACIONÁRIAS Características de uma FE ideal SELETIVA Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra. Regra geral: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático...) FE Seletiva: separação adequada dos constituintes da amostra FE pouco Seletiva: má resolução mesmo com coluna de boa eficiência

21 FASES ESTACIONÁRIAS Características de uma FE ideal AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS DE USO Maior flexibilidade na otimização da separação. BOA ESTABILIDADE QUÍMICA E TÉRMICA Maior durabilidade da coluna, não reage com componentes da amostra POUCO VISCOSA Colunas mais eficientes (menor resistência à transferência do analito entre fases) DISPONÍVEL EM ELEVADO GRAU DE PUREZA Colunas reprodutíveis; ausência de picos fantasma nos cromatogramas.

22 FASES ESTACIONÁRIAS FE Sólidas: Adsorção O fenômemo físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida ADSORÇÃO Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros) Solutos polares Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de eletrons...)

23 COLUNAS EMPACOTADAS Definições Básicas Tubo de material inerte recheado com FE sólida gra- nulada ou FE líquida depositada sobre suporte sólido. MATERIAL DO TUBO ø = 3 mm a 6 mm L = 0,5 m a 5 m aço inox vidro pirex níquel TEFLON Granulometria do recheio mesh m mesh m mesh m MESH dpdp Eficiência maximizada com: - Diminuição de d C - Diminuição de d p - Recheio regular Limitados pela resistência à passagem de gás de arraste

24 COLUNAS EMPACOTADAS FE Líquidas: Suporte A FE líquida deve ser disposta sobre um SUPORTE sólido área superficial entre 0,5 e 10 m 2.g -1 microporos regulares (~ 1 m) NÃO interagir com a amostra boa resistência mecânica Uso quase universal: TERRA DIATOMÁCEA Esqueletos fósseis (SiO 2 + óxidos metálicos) de algas microscópicas Chromosorb Anachrom Supelcoport... secagem calcinação fusão com soda lavagem com ácido silanização

25 COLUNAS CAPILARES Diâmetro Interno d C = Eficiência 0,10 mm 0,25 mm 0,32 mm 0,53 mm Valores comuns: 1 Colunas de altíssima eficiência (amostras complexas, Fast GC); capacidade volumétrica limitada de processamento de amostra 2 Diâmetros mais comuns; capacidade volumétrica limitada de amostra requer dispositivos especiais de injeção 3 Colunas megabore: menor eficiência, mas maior capacidade de processamento permite uso de injetores convencionais

26 COLUNAS CAPILARES Colunas Capilares: Injeção Septo; 2 - Entrada de gás de arraste; 3 - Liner (misturador); 4 - Coluna Capilar 5 - Purga de gás de arraste; 6 - Válvula de controle de purga. Baixa capacidade de processamento de amostra (sub-microlitro) Injeção direta com microseringa muito difícil !!! Injetores com divisão (splitters) Sistema pneumático despreza fração da amostra injetada - Menor sensibilidade (boa parte da amostra é desprezada) - Divisão da amostra raramente é uniforme (fração purgada dos constituintes menos voláteis é sempre menor) - Ajuste da razão de divisão é mais uma fonte de erros

27 COLUNAS CAPILARES Large Volume Injection (LVI) Combinando injetores com temperatura programada, vál- vulas controladas por microprocessador e pré-colunas pode ser feita injeção de grandes volumes (> 100 L) de amostra 1 Colunas e injetor frios; válvula de purga aberta (solvente é eliminado) 2 Colunas e injetor aquecidos; válvula de purga fechada (constituintes de interesse transferidos para coluna analítica)

28 COLUNAS CAPILARES Colunas Multicapilares Feixes paralelos de colunas capilares com d C convencional - Eficiência próxima à das colunas convencionais - Capacidade similar à das colunas empacotadas - Colunas mais curtas: análises mais rápidas Separação de explosivos em coluna multicapilar (OV-17, 1000 capilares x 6 m) 1 - 2,6-DNT 2 - 2,4-DNT 3 - 2,4,6-TNT 4 - 3,4,5-TNT 5 - 2,3,4-TNT 6 - RDX ? 7 - tetryl

29 DETECTORES Parâmetros Básicos de Desempenho QUANTIDADE MÍNIMA DETECTÁVEL Massa de um analito que gera um pico com altura igual a três vezes o nível de ruído SINAL (S) RUÍDO (N) = 3 S N RUÍDO Qualquer componente do sinal gerado pelo detector que não se origina da amostra Fontes de Ruído Contaminantes nos gases Impurezas acumuladas no detector Aterramento elétrico deficiente

30 DETECTORES Detector por Ionização em Chama PRINCÍPIO Formação de íons quando um composto é queimado em uma chama de hidrogênio e oxigênio O efluente da coluna é misturado com H 2 e O 2 e queimado. Como numa chama de H 2 + O 2 não existem íons, ela não conduz corrente elétrica. Quando um composto orgânico elui, ele também é queimado. Como na sua queima são formados íons, a chama passa a conduzir corrente elétrica

31 DETECTORES Detector por Ionização em Chama COLETOR FLAME TIP BLOCO AR H2H2 COLUNA O ar e o H 2 difundem para o interior do coletor, onde se misturam ao efluente da coluna e queimam: Uma diferença de potencial elétrico é aplicada entre o flame tip e o coletor - quando se formam íons na chama, flue uma corrente elétrica:

32 DETECTORES Detector por Ionização em Chama Química da Chama de Hidrogênio: Incandescência Reação Quebra Estrutura da chama três regiões básicas Região de quebra Mistura dos gases, pré-aquecimento, início da quebra das moléculas de H 2, O 2 e dos analitos. Zona de reação Reações exotérmicas com produção e/ou consumo de radicais H, O, OH, HO 2 (provenientes do H 2 ), CH e C 2 (proveniente do analito) e íons CHO + (analito). Zona de incandescência Emissão de luz por decaimento de espécies excitadas: OH (luz UV), C H e C2 (visível). Queima de substâncias com ligações C-H CH + O CHO + + e - 1 íon formado a cada ~10 5 átomos de C queimados Queima de H 2 Formam-se apenas radicais !!!

33 ventajas de la cromatografía gaseosa limitaciones de la cromatografía gaseosa 1.eficiente, permite alta resolución 1.la muestra debe ser volátil 1.requiere muestras pequeñas (ml) 1.no aplicable a muestras termolábiles 1.alta sensibilidad, detecta ppm y a menudo ppb 1.muestras sucias requieren de un clean-up previo 1.cuantitativa (en ciertas condiciones) 1.se debe utilizar otro sistema de detección (ej. MS) para la confirmación la identificación 1.alta velocidad de análisis 1.es necesario algo de entrenamiento y experiencia 1.buena exactitud 1.fácil de usar, bien conocida

34 BIBLIOGRAFIA


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