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Fontes de Microrganismos de Interesse Microrganismos de interesse industrial podem ser obtidos das seguintes formas:  Isolamento a partir de recursos.

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3 Fontes de Microrganismos de Interesse Microrganismos de interesse industrial podem ser obtidos das seguintes formas:  Isolamento a partir de recursos naturais;  Compra em coleções de culturas;  Obtenção de mutantes naturais;  Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais;  Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia genética.

4 Isolamento de microrganismos a partir de recursos naturais O isolamento de microrganismos a partir de recursos naturais, tais como solo, água, plantas, etc., sempre foi uma atividade de grande importância para a obtenção de novas linhagens de interesse industrial.  Atividade que envolve muito trabalho experimental;  Apresenta alto custo;  Leva a obtenção de linhagens melhor produtoras do que as atuais;  Leva a seleção de cepas que originem novos produtos. Grandes empresas produtoras de antibióticos ou enzimas mantêm programas de isolamento de linhagens de recursos naturais. Sabe-se, contudo, que cerca de 90% a 99% do número total de microrganismos que existem no Ambiente não são cultiváveis em meios de cultura e outras condições laboratoriais conhecidos. Este fato tem limitado a possibilidade de serem isolados, a partir do ambiente, microrganismos com potencial interesse para aplicações biotecnológicas.

5 O isolamento consiste na obtenção de culturas puras que envolvem somente o organismo de interesse. Inicia com a escolha da fonte mais provável de conter o microrganismo desejado, podendo ser: solo, água, ar, lodo, alimentos ou órgãos. Características que um determinado organismo possui para se desenvolver em certo ambiente são usadas como fatores seletivos no processo de isolamento. Para fazer o isolamento de um microrganismo, deve-se empregar o meio de cultivo mais adequado para o seu desenvolvimento. No preparo do meio muitas vezes emprega-se o ambiente natural como modelo de composição, pois os requerimentos nutricionais dos microrganismos refletem o tipo de ambiente onde ele é encontrado (condição balanceada de nutrientes, condições ótimas de temperatura, pH, pressão de oxigênio e umidade). O isolamento de um determinado microrganismo em cultura pura a partir de uma população mista envolve:  Uso de meios de cultura sólidos;  Técnicas de isolamento de colônias (método de espalhamento em placa);  Seleção de colônias por produto formado ou morfologia.

6 Coleções de Culturas Objetivo: preservação e manutenção das culturas de forma a manter sua sobrevivência, estabilidade e pureza durante períodos prolongados de tempo, conservando as características genéticas e propriedades morfológicas/fisiológicas. Tabela: Autoridades de depósitos internacionais PaísInstituto AustráliaThe National Measurement Institute (NMI) BélgicaBelgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM TM) BulgáriaNational Bank for Industrial Microorganisms and Cell Cultures (NBIMCC) CanadáNational Microbiology Laboratory, Health Canada (NMLHC) ChinaChina Center for Type Culture Collection (CCTCC); China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC) FrançaCollection nationale de cultures de micro-organismes (CNCM) AlemanhaDSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) HungriaNational Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (NCAIM) IndiaMicrobial Type Culture Collection and Gene Bank (MTCC) ItáliaAdvanced Biotechnology Center (ABC); Collection of Industrial Yeasts DBVPG; EspanhaBanco Nacional de Algas (BNA); Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) JapãoInternational Patent Organism Depositary (IPOD), National Institute of Advance Industrial Science and Technology (AIST); National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary (NPMD) RussiaNational Research Center of Antibiotics (NRCA); Russian Collection of Microorganisms (VKM); Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) Estados UnidosAgricultural Research Service Culture Collection (NRRL); American Type Culture Collection (ATCC) Fonte: CAMEOTRA, S. S. Preservation of microorganisms as deposits for patent application. Biochemical and Biophysical Research Communications 353, 2007,

7 No Brasil: Na maioria dos casos, os pesquisadores são os responsáveis pela manutenção e conservação de suas culturas.  Fundação André Tosello – Campinas, SP – CCT – Coleção de Culturas Tropical  Secretaria de Agricultura e Abastecimento - Coleção de Culturas IBSBF do Instituto Biológico – Campinas, SP –  Instituto Oswaldo Cruz - IOC/FIOCRUZ – Rio de Janeiro, RJ – Coleções Científicas - Coleções Microbiológicas  Instituto Adolfo Lutz – São Paulo, SP –  Instituto Zimotécnico – ESALQ - Piracicaba, SP: fungos leveduriformes de interesse industrial.  Coleção do Prof. Lacaz (Hospital de Medicina Tropical de São Paulo), São Paulo, SP.

8 Mutantes Naturais e Induzidos por Métodos Convencionais Como se sabe, como uma dada célula prolifera, há sempre uma pequena possibilidade de surgimento de mutantes naturais, os quais podem ser isolados e ensaiados objetivando a verificação de sua potencialidade de produção. O surgimento de células mutantes pode levar muito tempo, por isso, pode-se utilizar métodos que forcem o processo de mutação como a exposição da suspensão a radiações ultravioletas ou a adição de substâncias mutagênicas como a nitrosoguanidina. Essa técnica de seleção é aleatória, tratando-se de recuperar as células sobreviventes em meios ou condições específicas. Tais programas de mutação/seleção são bastante dispendiosos, mas levaram a várias condições de sucesso descritas na literatura. Um caso de melhora de linhagem descrito na literatura é o da Penicillium chrysogenum para a produção de penicilina.  Década de 40 – 100 unidades/cm 3.  Em 1976 – unidades/cm 3.  Entre 1970 e 1985 – /cm 3.

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10 Obtenção de Microrganismos Recombinantes por Técnicas de Engenharia Genética Nas últimas décadas, as técnicas de engenharia genética (tecnologia de DNA recombinante) trouxeram um imenso avanço nas possibilidades de se obter células mais produtivas ou produtoras de substâncias que normalmente não produziam. A introdução de fragmentos de DNA de certas células em outras, através de vetores (plasmídeos), permite a obtenção de células alteradas geneticamente, porém de forma muito mais dirigida do que as metodologias convencionais anteriormente citadas. Esta técnica é utilizada atualmente para:  Produção de proteínas heterólogas;  Resolução de problemas de reação limitante em uma determinada cadeia de reações;  Células produtoras de determinadas substâncias que naturalmente não produziriam.

11 Características Desejáveis dos Microrganismos Para uma aplicação industrial, espera-se que os microrganismos apresentem as seguintes características gerais:  Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto: As matérias-primas incidem pesadamente no custo do produto final, variando entre 38 a 73% do custo total de produção (fonte de carbono);  Permitir o acúmulo do produto no meio: ter elevada concentração do produto no caldo fermentado reduz os custos de recuperação;  Não produzir substâncias incompatíveis com o produto, pois isto pode levar ao desinteresse pelo processo, por exemplo: se o interesse é por produzir determinada enzima e a célula secreta para o meio proteases. Ao produzir a enzima, pode-se ter uma redução da atividade enzimática no produto final pela ação das proteases. O microrganismo ideal deve produzir o mínimo de outras substâncias, ao mesmo tempo em que sintetiza o composto pretendido. Isso leva a uma maior disponibilidade de nutrientes para a síntese do produto e maior facilidade na recuperação deste produto;

12  Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico: isso significa que não basta ter uma linhagem hiperprodutora de uma dada substância, mas que se conheça as técnicas de sua conservação e, mais ainda, que ela se mantenha como excelente produtora durante todas as etapas envolvidas no processo (proliferação em nível de laboratório, germinadores e biorreator principal). Que não apresente mutações naturais relevantes;  Não ser patogênico: diminuição dos riscos de contaminação ambiental, logo diminuição nos custos. O cultivo de patogênicos é efetuado, por exemplo vacinas, em biorreatores de pequeno porte (100 L a 1000 L), em condições assépticas. Isso significa custo adicional, o qual pode ser justificado para a produção de vacinas, mas inviável na produção de enzimas ou antibióticos;  Não exigir condições de processo muito complexas: por motivos claros de economia;  Não exigir meios de cultura dispendiosos: por questões claras de economia. Essa é a razão pela qual um maior conhecimento das necessidades nutricionais de uma linhagem é estudo de vital importância, objetivando o fornecimento dos nutrientes apenas necessários;  Permitir a rápida liberação do produto para o meio: diminui os custos com os processos de recuperação do produto desejado.


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