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Correlações do Polimorfismo Genético do Vírus Linfotrópico de Células-T Humanas do Tipo 1 (HTLV-1) com o Polimorfismo dos genes do Hospedeiro Envolvidos.

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1 Correlações do Polimorfismo Genético do Vírus Linfotrópico de Células-T Humanas do Tipo 1 (HTLV-1) com o Polimorfismo dos genes do Hospedeiro Envolvidos no Desenvolvimento de TSP/HAM em Salvador. Pesquisador PRODOC: Luiz Carlos Alcântara Responsável Institucional: Bernardo Galvão-Castro Área: Medicina da Saúde – Sub-área: Epidemiologia molecular dos microorganismos

2 1.Caracterização molecular do genoma proviral (U3- LTR) dos indivíduos infectados – Análise dos polimorfismos destas regiões relacionando os mesmos com o desenvolvimento de TSP/HAM; 2.Caracterização molecular de genes do hospedeiro envolvidos no mecanismo de transativação por Tax (promotores de IL2, IL2-R, IL6) em indivíduos infectados assintomáticos e com TSP/HAM; 3.Determinar a carga proviral nos indivíduos infectados, assintomáticos e com TSP/HAM, correlacionando estes resultados com as alterações genotípicas do hospedeiro.

3 QUAL A IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DO POLIMORFISMO NA REGIÃO LTR VIRAL?

4 LTR GAG POL ENV X LTR 5’ 3’ 5’ Ainda não se sabe porque a infecção pelo HTLV-I na maioria dos indivíduos resulta em uma infecção assintomática, enquanto poucos desenvolvem doença. Há poucas investigações que têm determinado correlações entre as manifestações clínicas e as alterações polimórficas nos genes provirais envolvidos na patogenicidade de Tax. Correlações entre o polimorfimo viral e o desenvolvimento de TSP/HAM no Japão.

5 U3RU5 21-pb enhancer ATT TATA box ESTRUTURA DO LTR DO HTLV-I Sinal de poliadenilação poliadenilação

6 3’ 5’ LTR GAG POL ENV X LTR 5’3’ TAX CREB/ATF TAX/CREB 5’ 3’5’ 3’ U3RU5 LTR TRE 1TRE 2TRE 3 Transcrição 9032 pb TRE - Elemento de resposta a TAX

7 Manuscrito em fase final de preparação ( Trabalho premiado da Jornada Científica do IOC/FIOCRUZ ) POPULAÇÃO ESTUDADA ( n=88 ) CHTLV n= 6 TSP/HAM total= 36 FNN n= 30 CHTLV n= 34 ASSINTOMÁTICOS POPULAÇÃO GERAL n=3 total= 52 FNN n=12 ACRE n= 3

8 CHTLV n= 18 Menor 45 anos BAHIA AZUL n=3 total n=32 ASSINTOMÁTICOS FNN n= 9 ACRE n= 2 Maior 45 anos CHTLV n=16 FNN n=3 total=20 ACRE n=1

9 RESULTADOS Análise da Freqüência de Mutações no gene LTR3’ (355 pb) *A significance level p<0.05 value was calculated by x 2 test Table 1: Analysis of the frequency (%) of mutations in gene LTR3’ (355pb) between asymptomatic and symptomatic group. Comparing with the LTR ATK1 Japanese prototype: We detected a -632C>T mutation (19,2%; p=0.024).

10 Table 2: Analysis of the frequency (%) of mutations in gene LTR3’(355pb) asym patients by age (up and down 45), comparing with the LTR ATK1 Japanese prototype: the C insertion was detected only in younger asym patients (25%, p=0.017). * A significance level p <0.05 value was calculated by x 2 test RESULTADOS PRELIMINARES Análise da Freqüência de Mutações no gene LTR3’ (355 – 55 pb)

11 A mutação -632C>T está presente no grupo assintomático (19,2%; p=0.024). Quando dividimos os pacientes assintomáticos pela idade (menor e maior que 45), uma inserção na posição -631C foi detectada somente no grupo com maior idade (25%, p=0.017). Estudos anteriores não encontraram correlações entre variações gênicas específicas e as diversas manifestações clínicas como ATLL e TSP/HAM (Osame et al., 2000). Em resumo, as mutações detectadas na região U3-LTR dos isolados do HTLV-1 poderiam estar relacionadas com a eficiência no mecanismo de transcrição viral e desenvolvimento da TSP/HAM. Na análise filogenética, todos os isolados da América Latina (do subtipo Cosmopolita, subgrupo Transcontinental) apresentaram as mutações nas posições –632 e –452, enquanto as mutações –595, -471 e –631 foram encontradas apenas fora deste grupamento.

12 QUAL A IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DO POLIMORFISMO NOS PROMOTORES DAS CITOCINAS?

13 Ainda não se sabe porque a infecção pelo HTLV-I na maioria dos indivíduos resulta em uma infecção assintomática, enquanto poucos desenvolvem doença. Há poucas investigações que têm determinado correlações entre as manifestações clínicas e as alterações polimórficas nos genes das várias proteínas do hospedeiro envolvidas na patogenicidade de Tax. Estudo das propriedades moleculares e biológicas dessas proteínas nos indivíduos infectados fornecerá informações importantes sobre a patogenicidade do vírus; Correlações entre o polimorfimo nos genes do hospedeiro e o desenvolvimento de TSP/HAM no Japão.

14 IL-6 Células B Células T Células T citotóxicas Células tronco hematopoiéticas Diferenciação e secreção de anticorpos Produção de IL-2 e de receptor de IL-2 Atividade estimuladora de colônia Potencializa a diferenciação na presença de IL-2 e IFN-  Co-estimulante  IL-6

15 IL-6 IL-1 TNF-  fator de crescimento derivado de plaquetas endotoxinas infecção viral glicocorticóides esteróides Ativação de macrófagos e células T Crescimento e diferenciação de células B Resposta de fase aguda Hematopoiese + +  Normalmente IL-6 é expressa em níveis muito baixos.  Infeçção, estresse, trauma:  níveis  Menopausa e andropausa:  níveis Ershler WB & Keller ET, 2000

16  Vários estudos têm mostrado correlação: polimorfismos em genes de citocinas, entre elas IL-6, e susceptibilidade/ resistência a algumas doenças  lupus, artrite reumatóide, diabetes, artrite juvenil  Polimorfismos de um único nucleotídeo: SNP  podem afetar a transcrição e a produção de citocinas fenótipos alto, intermediário e baixo produtor. Fishman et al, 1998

17  A freqüência dos polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP) em genes de citocina e dos haplótipos podem diferir em populações com diferentes “backgrounds” (Cox et al. 2001; Meenagh et al. 2002; Darrin et al, 2001; Padyukov et al, 2001; Meenagh et al, 2002).  ORIGEM GENÉTICA  Susceptibilidade a várias doença  ETNIA X POLIMORFISMO X SUSCEPTIBILIDADE/RESISTÊNCIA A DOENÇAS

18 NF-  B TATA NFIL G C Representação esquemática da região 5’ do gene de IL-6, identificando os dois polimorfismos estudados e sítios de ligação para fatores de transcrição MRE Região de -180 a -123 é CRUCIAL para a transcrição de IL-6 induzida por vírus, segundos mensageiros e citocinas como IL-1 e TNF-  Adaptado de Terry et al, 2000 G C G A

19  A freqüência de –174G/C IL-6 é altamente heterogêneo entre diferentes populações (Fishman et al. 1998; Cox et al. 2001; Hoffman et al. 2002), mas a variante –634G/C IL-6 foi estudada apenas em amostras asiáticas (Nishimura et al. 2002; Kitamura et al. 2002; Yamada et al. 2003).

20  SNP –174 (G  C): artrite reumatóide juvenil (Fishman et al, 1998), mal de Alzheimer (Licastra et al, 2003), hiperandrogenismo (Villuendas et al, 2002), susceptibilidade à diabetes tipo I (Jahromi et al, 2000), desenvolvimento de doenças cardiovasculares (Jenny et al, 2002).  SNP -634 (G  C): progressão da nefropatia diabética (Kitamura et al, 2002), diminuição da densidade mineral óssea (Ota et al, 2001).

21 Ø Polimorfismos nos promotores de IL-6 X Pacientes infectados com HTLV-I Ø População do Japão Ødiferença na distribuição do polimorfismo no promotor de IL-6 na posição –634 entre indivíduos HTLV-I positivos, assintomáticos e com HAM/TSP (Nishimura e cols, 2002).

22 Pergunta: Existe associação desses Polimorfismos com a manifestação de TSP/HAM em indivíduos infectados com HTLV-1 de Salvador, Bahia, Brazil? G A GG GC CC T ?

23 Resultado 1: 3 populacões brasileiras 293 amostras coletadas entre 1997 e 2001: 100 da população geral de Salvador (Dourado et al. 2003); 94 doadores de sangue de descendentes de Alemães de Joinville (Grimaldi et al. 2002); 99 da tribo Tiriyo, fronteira Brasil/Suriname (Shindo et al. 2002) ETHNIC DIFFERENCES IN THE DISTRIBUTION OF INTERLEUKIN- 6 POLYMORPHISMS AMONG THREE BRAZILIAN ETHNIC GROUPS. Gadelha, S.R. 1 ; Alcântara, L.C.J. 1,2 ; Costa, G.C.S. 1 ; Rios, D.L. 1 ; Galvão- Castro, B. 1,2 1 Laboratório Avançado de Saúde Pública/Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz/ Fundação Oswaldo Cruz, Salvador, Ba; 2 Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública/ Fundação Bahiana para o Desenvolvimento das Ciências. Key words: interleukin-6, polymorphisms, Brazilian populations

24 Tabela 1.1 Percentagem genotípica e freqüência alélica de polimorfismos no promotor do gene de IL-6 IL-6 nas posições – 634G/C e –174G/C em três populações Brasileiras. GG N (%) GC N (%) GC N (%) G N (%) C N (%) -634 Salvador68 (68.0)30 (30.0)02 (2.0)166 (83.0)34 (17.0) Tiriyó18 (18.2)52 (52.5)29 (29.3)88 (44.4)110 (55.6) Joinville87 (92.6)7 (7.4)-181 (96.3)07 (3.7) -174 Salvador71 (71.0)25 (25.0)04 (4.0)167 (85.2)29 (14.8) Tiriyó94 (94.9)5 (5.1)-193 (97.5)5 (2.5) Joinville43 (45.75)33 (35.1)18 (19.15)119 (63.3)69 (36.7) *  2 : , df: 2; p<0.001 (freqüência alélica)  2 : , df: 2; p<0.001 (freqüência alélica).

25 Tabela 1.2. Freqüência dos haplótipos (combinação -634G/C e –174G/C) no promotor de IL-6 em três diferentes populações do Brasil Salvador (n*=200) % Tiriyó (n*=198) % Joinville (n*=188) % -634G/-174G G/-174C C/-174G C/-174C-0.8- *n= número de cromossomos Salvador X Tiriyó: teste exato de Fisher: p<0,0001 Salvador X Joinvile: teste exato de Fisher: p<0,0001 Tiriyó X Joinvile: teste exato de Fisher: p<0,0001

26 Cox et al, 2001; # Hoffman et al, 2002; ** Hayakawa et al, 2002; ## Zhai et al, 200; & Fishman et al, 1998 Tabela 1.3. Freqüências alélicas do polimorfismo –174 IL-6G>C nos principais grupos étnicos Africanos/ Afro-descendentes % Asiaticos/ Ameríndios % Europeus/ Europeus- descendentes % IL G *,# (83.5) 95.5 – 100 #,**,##,& (97.5) 61.7 # (63.3) C *,# (16.5) #,**,##,& (2.5) 38.3 # (36.7)

27  As frequências alélicas dos polimorfismos -634G/C p<0.001) e -174G/C (p<0.001) diferiram nas três populações.  As frequências dos haplótipos variaram significativamente (p<0.0001) (Tabela 2).  A maior frequência do alelo C na posição –174 em descendentes alemães de Joinville é consistente com aqueles demosntrados previamente em populações de Europeus (Tabela 3). Resultados e Discussão Polimorfismos X Grupos étnicos

28  A frequência do alelo C na posição –174 em amostras de Salvador, embora um pouco maior que aquelas previamente observadas em Africanos e Afro-Americanos, está próximo daqueles descritos (Table 3). Este achado é consistente com dados históricos que mostram a importância da contribuição africana e européia em Salvador (Alcantara et al., JAIDS 2003; Alcantara et al., AIDS 2006).  A mais baixa frequência do alelo C na posição –174 foi encontrada na tribo Tiriyo. Esta frequência está na faixa observada para populações de origem asiática (Tabela 3). Estes dados são consistentes com a teoria da origem asiática dos Ameríndios, confirmando estudos anteriores em outros sistemas polimórficos (Ribeiro et al. 2003; Tokunaga et al. 2001).

29  Poucos estudos têm investigado o polimorfismo –634G  C no promotor do gene de IL-6, e todos foram realizados em populações asiáticas.  Este é o primeiro trabalho investigando este polimorfismo nestes grupos étnicos.  Primeiro estudo verificando freqüência dos haplótipos (-634 G  C e -174G  C).

30 Resultados 2 Polimorfismos nos promotores dos genes da interleucina-6 em indivíduos infectados de SALVADOR. Existe associação com o desenvolvimento de doença neurológica? Manuscrito em fase final de preparação

31  Tipo de estudo: Corte-transversal  População alvo: Pacientes portadores de HTLV-I de demanda espontânea ou referenciada para o Centro de HTLV da Fundação Bahiana para o Desenvolvimento das Ciências (FBDC), confirmadamente positivos.  Número de amostras analisadas:  Indivíduos assintomáticos: 84  Pacientes com HAM/TSP: 26  Sintomáticos: 23  Soronegativos: 100

32 Idade (Mediana) HAM/TSP Oligosintomáticos 52.5 anos 51 anos Assintomáticos38 anos Gênero HAM/TSP: 26 Masculino Feminino Assintomáticos: (34.6%) 17 (65.4%) Masculino Feminino 31 (36.9%) 53 (63.1%) Oligosintomáticos: 24 Masculino Feminino 09 (39.1%) 14 (60.9%)

33 Tabela 2.0. Frequência alélica do polimorfismos nas posições – 634 e –174 do promotor de IL-6 em indivíduos infectados pelo HTLV-I atendidos no CHTLV/FIOCRUZ e indivíduos soronegativos provenientes de Salvador/ Bahia. HTLV-1 positivo N (%) HTLV-1 negativo N (%) Posição –634 Alelo G246 (89.1)166 (83) Alelo C30 (10.9)34 (17) Posição –174 Alelo G240 (87.0)167 (85.2) Alelo C36 (13.0)29 (14.8) p>0.05

34 Assintomático N (%) HAM/TSP N (%) Posição –634 Alelo G152 (90.5)41 (78.8) Alelo C16 (9.5)11 (21.2) Posição –174 Alelo G145 (86.3)49 (94.2) Alelo C23 (13.7)03 (5.8) Tabela 2.1. Frequência alélica do polimorfismos nas posições –634 e –174 do promotor de IL-6 em indivíduos infectados pelo HTLV-I assintomáticos, oligosintomáticos, com HAM/TSP, e em indivíduos soronegativos -174GC -  do alelo G e  do alelo C nos indivíduos com HAM/TSP quando comparados com indivíduos oligosintomáticos (p=0.03). HAM/TSP X assintomáticos: p= GC -  Alelo C em HAM/TSP em relação aos assintomáticos (p=0.03) e oligosintomáticos (0.01). Assint X Oligos p=0.5 Oligosintomático N% 43 (93.5) 06 (6.5) 36 (78.3) 10 (21.7)

35 Tabela 2.2. Freqüência dos haplótipos (combinação -634G/C e –174G/C) no promotor de IL-6 nos indivíduos infectados pelo HTLV-1. HAM/TSP n(%) OLIGOSSINTOMÁTICOS n(%) ASSINTOMÁTICOS n(%) -634GG/-174GG*13 (50)13 (56.5)52 (61.9) -634GG/-174GC01 (3.8)05 (21.7)13 (15.5) -634GG/-174CC-02 (8.7)03 (3.6) -634GC*/-174GG*10 (38.5)02 (8.7)13 (15.5) -634GC*-174GC02 (7.7)01 (4.4)02 (2.4) -634GC*/-174CC--01 (1.1) *genótipos relacionados a uma maior susceptibilidade a HAM/TSP

36 -597 G/A Monomórfico: todas as amostras foram GG -572 G/C A três genótipos G/A (3.8%). Todos os demais G/G (96.2%) Promotor de IL-2:  20 amostras sequenciadas – fragmento de 310pb – região onde NF-  B se liga ë10 pacientes sintomáticos e 10 assintomáticos para o HTLV– nenhuma diferença/ nenhum polimorfismo detectado

37 Carga proviral

38  14 pacientes HAM/TSP  53 assintomáticos Carga proviral (número de cópias/10 6 cels) HAM/TSP X Assintomáticos número de cópias/10 6 cels Mann-Whithney: p=0.0001

39 Mann-Whithney: p= G/C MedianaGG: cópias/106 céls GC: cópias/106 céls Carga proviral X Genótipo na posição -634 do promotor de IL-6 Mann-Whithney: p=0.97 Carga proviral X Genótipo na posição -174 do promotor de IL G/C MedianaGG: cópias/106 céls GC: cópias/106 céls número de cópias/10 6 cels

40 Bernardo Galvão Castro Filho (Coordenador) Sandra Rocha Gadelha (Doutorado) Sérgio de Araújo Pereira (Doutorado) Giselle Calazans de Souza Costa (Iniciação científica e mestrado) Cinara Carvalho(Apoio técnico); Simone Kashima (Colaborador) Anne-Mieke Vandamme (Colaborador) Ceuci Nunes (Clínica) Rodrigo Gaspar (Administração do projeto) Equipe do LASP/CPqGM e Centro de HTLV (FBDC/EBMSP) FAPESB


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