Grupo 2 – Nanotecnologia:

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1 Grupo 2 – Nanotecnologia:
Cláudia Turra - Física Gabriel Kaulfmann - Informática Ismael Osmari - Química Michelli Antonow - Farmácia Profª Drª Solange Binotto Fagan Profª Drª Marta Palma Alves Profª Drª Renata P. Raffin

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3 SUMÁRIO Introdução Materiais e Métodos Resultados e Discussão
Conclusão 3 3 3

4 O objecivo deste trabalho foi desenvolver nanopartículas lipídicas sólidas e avaliar o potencial dessas nanopartículas como portadoras de Penciclovir para aplicação tópica. Materiais e preparação das SLNs Caracterização Físico-química das SLNs Avaliação da permeação percutânea in vitro e comportamentos da absorção na pele Análise por HPLC do Penciclovir Investigação sobre os mecanismos de penetração SLNs Caráter promissor das SLNs como carregadoras de Penciclovir na aplicação tópica. 4 4 4

5 INTRODUÇÃO Inibidor: Vírus herpes simplex tipo 1 e tipo 2.
Penciclovir é um nucleosídeo sintético análogo, é um potente e altamente seletivo inibidor do vírus da herpes. Inibidor: Vírus herpes simplex tipo 1 e tipo 2. Vírus varicela-zoster. Vírus Epstein-Barr. Vírus da hepatite e citomegalovírus. 5 5 5

6 Mas... A biodisponibilidade oral do Penciclovir é muito baixa (5 à 10%) e sua aplicação clínica é muito restrita. Sendo que... Um caminho promissor de administração do penciclovir é a entrega tópica. O que tem atraído a atenção de pesquisadores As várias formulações tópicas na literatura incluindo gel, creme e veículos adequados com capacidade de permeação alta. Na qual 6 6 6

7 A alternativa que surge é...
Nanopartículas lipídicas sólidas (SLNs) Sendo utilizada como transportadora do Penciclovir Devido vantagens como: Irritação da pele desprezível. Da protecção para as substâncias ativas. Liberação controlada. 7 7 7

8 MATERIAIS Poloxamer 188 e Brij 78 foram obtidos da Sigma Chemical (St. Louis, MO, EUA). O Penciclovir (pureza 99%) foi comprado da Livzon Pharmaceutical Group Co., Ltd. (Changzhou, China). Fosfatidilcolina de ovo (EPC) foi obtido a partir Lipoid (Ludwigshafen, Alemanha). Monoestearato de Gliceril (GMS) foi fornecido pela Shanghai Co. Ltd. (China Shanghai). Diclorometano, Tween 80 e Tween 20 foram adquiridos da Yongda reagente químico Co. Ltd. (Tianjin, China). 8 8 8

9 MÉTODOS PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍUCLAS LIPÍDICAS SÓLIDAS
SLNs foram preparados por técnica de dupla emulsão (água/óleo/água) com ligeiras modificações. 6mg de penciclovir foi dissolvido numa solução de 200 µl de hidróxido de sódio 0,1 M. fase de óleo foi preparada por dissolução de uma quantidade diferente de GMS e 40mg de EPC em 1 ml de diclorometano. 9 9 9

10 A fase interna aquosa foi misturada com a fase de óleo e em seguida submetida a sonda ultra-sônica por 60 segundos de 40 Watts para obter a primeira parte da emulsão água/óleo. A emulsão água/óleo/água foi formado após a adição de 3,8 ml da solução com surfactante em diferentes concentrações e em seguida passou por sonicação por 18 segundos em 40 Watts. A emulsão formada foi mantida em 25 ºC sob agitação mecânica em 700 rpm por 5 h para remover o solvente orgânico e formar as SLNs. 10 10 10

11 As variáveis como a concentração de GMS, tensoativos na fase externa e suas concentrações estão diretamente ligadas a eficácia das SNLs contendo Penciclovir. Sendo que estas... Foram investigadas para conseguir uma formulação ideal. O pó de SLNs foi preparado por liofilização com 5,0% manitol como agente de apoio, a fim de facilitar a investigação. As amostras de SNLs dispersão com manitol foram congeladas em um freezer ultra frio a -80°C durante 24 h, em seguida, liofilizadas utilizando um liofilizador em -40°C, com pressão de 0,10 mbar por 48 h para produzir o pó seco. 11 11 11

12 Caracterização físico-química das SLNs
Tamanho de Partícula e Potencial Zeta Diâmetro – PCS – distribuição de volume Potencial Zeta 25° C triplicata 12

13 Morfologia Placa de cobre Tingimento com PTA Excesso removido
Secagem da amostra Análise com TEM 13

14 10.000 rpm centrifugação 1h 25° C ultrafiltração
Eficiência de Encapsulação (EE) e Carregamento de Fármaco (DL) rpm centrifugação 1h 25° C ultrafiltração 14

15 Estudo de Estabilidade
Estabilidade Físico-química: T = 4° C t = 3 meses Transparência Tamanho de partícula EE Estabilidade Física: Teste de centrífuga – rpm/30 minutos 15

16 Análise de calorimetria diferencial de varredura (DSC)
Células de Al 10° C/min → ° C 16

17 Permeação percutânea in vitro e comportamento de absorção na pele
Preparação da pele Ratos Wistar machos (~200g) Pêlos removidos Pele da região abdominal Integridade – lâmpada de inspeção 17

18 Estudo de permeação in vitro
Amostras com 3,8 cm2 Hidratação 37° C – 600 rpm 1,2 mg de penciclovir 800 μl de suspensão 120 mg de creme Aplicação na pele 18

19 Cálculo dos dados de permeação in vitro
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20 Determinação do conteúdo de fármaco na epiderme e na derme
2, 6 e 12 horas após tratamento Excesso removido – lavagem com álgool e água Imersão em água destilada (2 min) Epiderme/Derme – ácido perclórico (24 h) Homogeneização (1 min) Sonicação (1 h) Centrifugação 20

21 Análise HPLC do penciclovir
HPLC + coluna Alíquotas de 20 μg Ensaio linear para 1-50 μg/ml Nenhuma interferência Filtro de membrana de celulose 21

22 Investigação do mecanismo de reforço de penetração
Efeito das SLNs na superfície da pele do rato Encontrar efeito tópico nas peles Estudos patológicos – formalina 10% coloração com hematoxilina/eosina figuras microscópicas - microscópio 22

23 Investigação DSC Epiderme em filtro com tripsina
4° C por 24h/ 37° C por 1h EC removido - tripsina Enxágue – “dessecador” Amostra dividida – análise em DSC 23

24 Resultados e discussão
Otimização de Formulação Para otimizar SLNs penciclovir foi elaborado um método de dupla emulsão, diferentes variáveis na formulação foram avaliados. 24 24

25 Otimização de Formulação:
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26 Caracterização: 26 26

27 Estabilidade: SLNs Penciclovir apresentaram uma boa estabilidade durante o período de três meses; Nenhuma alteração óbvia de clareza e de degradação foram encontrados; O diâmetro médio delas foi 264,5 ± 9.3nm. 27 27

28 Estudo DSC: 28 28

29 Permeação cutânea e comportamentos de absorção da pele:
Fig. 3. Percutaneous permeation profiles of penciclovir from the SLNs and the commercial cream through the excised rat skins (mean±S.D.; n = 5). 29 29

30 Permeação cutânea e comportamentos de absorção da pele:
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31 Permeação cutânea e comportamentos de absorção da pele:
Fig. 4. The amount of penciclovir in epidermis (a) and dermis (b) after 2, 6, and 12 h, respectively. 31 31

32 Efeito na superfície da pele de ratos:
Fig. 5. Microphotograph (400×) of vertical section of rat skin (H/E staining): (a) untreated skin, (b) skin treated with commercial cream, and (c) skin treated with penciclovir-loaded SLNs. 32 32

33 CONCLUSÃO SLNs de Penciclovir penetrou na pele de ratos 2 X mais que o creme comercial, com um controle de 12 após a administração. SLNs de Penciclovir teve um aumento de 130% na penetração na derme comparado com o creme comercial. O estudo mostrou que as SLNs aumentaram a penetração de Penciclovir. 33 33

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