Toxóides Toxina destoxificada (destruição das propriedades tóxicas através do calor ou formaldeído) sem perder as propriedades imunogênicas = toxóide ou.

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1 Toxóides Toxina destoxificada (destruição das propriedades tóxicas através do calor ou formaldeído) sem perder as propriedades imunogênicas = toxóide ou anatoxina. Exotoxinas – termolábeis e dão origem a anticorpos específicos. 3 grupos: Ligadas firmemente as células, podendo ser liberadas com processos especiais. Neurotoxina de Shigella shigae e toxina Pasteurella pestis. Que se difundem livremente no meio durante a reprodução ([]intra ~[]extra). Toxina diftérica e do Staphylococcus aureus. Que se difundem mas []intra>[]extra (só se iguala quase ao cessar a reprodução). Toxina tetânica e muitas do gênero Clostridium.

2 Toxóide diftérico Corynebacterium diphtheriae – gram-positiva, infecção no trato respiratório superior e na parte cutânea. Toxina diftérica: polipeptídeo (duas cadeias A- responsável pela toxidez e B- responsável pela penetração) – anticorpos que protegem da infecção contra B. Presença de proteínas estranhas no toxóide leva a reações colaterais (febre) – várias vezes em doses moderadas. Tentativas de peptídeos sintéticos (em teoria menos tóxicos).

3 Produção / purificação
Fermentação, filtração tangencial do meio fermentado, filtração molecular do filtrado (separação dos nutrientes residuais e metabólitos da toxina), cromatografia, destoxificação (desnaturação com formaldeído 0,5% 37ºC, 4 a 6 semanas), nova cromatografia, filtração esterilizante do toxóide purificado. Pode ser misturada com toxóide tetânico (DT) ou este e a vacina contra coqueluche (DTP). Hidróxido ou fosfato de alumínio são adicionados como adjuvantes para aumentar a imunogenicidade da vacina.

4 Toxóide tetânico Clostridium tetani – bacilo gram-positivo. A doença não imuniza o paciente pois a toxina é tão potente que age no sistema nervoso em doses baixíssimas. A bactéria forma esporos termoestáveis – toda produção em prédio separado. Extremamente anaeróbio – agitação sem aeração. “Incinerador” na linha de exaustão do fermentador (filtro de saída) – evitar contaminação ambiental por esporos arrastados pelo nitrogênio insuflado na fermentação.

5 Produção / purificação
Após 6 dias de cultivo toda a toxina é liberada no meio devido a lise celular. No entanto a liberação de enzimas proteolíticas pode diminuir o título da toxina. O oxigênio pode inibir parcialmente a ação destas enzimas. Após a fermentação passa-se por uma filtração tangencial, filtração molecular do meio, cromatografia, destoxificação (formaldeído 0,5%, pH 7,6 – carbonato ou bicarbonato de sódio – 37C por 4 semanas), nova cromatografia, e filtração esterilizante do toxóide. Tentativas de produção do peptídeo sintético (por engenharia genética) para evitar os efeitos colaterais da vacina convencional.

6 Meningite meningocócica (B e C)
Neisseria meningitidis – coco gram-negativo, aeróbio ou anaeróbio facultativo. 12 sorogrupos: A, B, C, H, I, K, L, X, Y, Z, 29E (Z’) e W135. 90% dos casos (mundo) – A, B e C. Grupo A: Ásia e África. B e C: Europa e Américas. EUA 15%: Y e W135. Vacina contra o meningococo B: proteínas de membrana. Vacina contra C: polissacarídeos capsulares.

7 Vacinas virais Reprodução dos vírus é feita em culturas in vitro de células animais. Cultivo estático: monocamadas de células crescidas sem agitação até que toda a superfície fique coberta, posterior inoculação do vírus com rápida propagação causando ou não a lise celular. Separação, purificação, inativação ou não – vacina viral.

8 Vacinas virais Cultivo submerso: diminui a possibilidade de contaminação e o grande número de frascos. Maior uniformidade, controles mais fáceis e cultivo mais homogêneo. Fonte de grandes quantidades de células. Problemas: células não se multiplicam livremente – esferas microscópicas ou microcarregadores em suspensão. Definição das necessidades nutricionais do cultivo, acúmulo de subprodutos do metabolismo e sua remoção, transferência de oxigênio no biorreator, sensibilidade as restrições físicas e fisiológicas no crescimento, métodos analíticos adequados.

9 Exemplos de vacinas Vacinas humanas Vacinas veterinárias Poliomielite
Febre aftosa Sarampo Raiva Rubéola Encefalite eqüina Influenza Febre bovina efêmera Caxumba Doença de Mareck (galinhas) Doença de Newcastle (pintos) Herpes Cinomose canina Varicela-zoster

10 Vacinas de DNA Novas tentativas, diminuição de efeitos colaterais e problemas com crescimento de patógenos

11 Histórico Wolff e col. (1990) observaram que células de músculo de rato expressavam antígenos codificados por DNA plasmidial injetado via intramuscular. Ulmer e col. (1993) mostraram que imunização de DNA, com nucleoproteína de influenza A, gerou respostas imunes celulares específicas à nucleoproteína e proteção de uma infecção subseqüente com cepas heterólogas de influenza. Foram usadas imunizações de DNA em modelos animais para obter imunidade protetora contra vários patógenos infecciosos (Weiner e Kennedy 1999) (Donnelly e col. 1997). Resposta imune celular contra malária e peptídeos de HIV em seres humanos através de vacinação de DNA indicou a possibilidade para aplicação clínica desta técnica de imunização.

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13 Vantagens Fornece ao organismo hospedeiro a informação genética necessária para que ele fabrique o antígeno com todas as suas características importantes para geração de uma resposta imune. Isto sem os efeitos colaterais que podem ser gerados quando são introduzidos patógenos, ou os problemas proporcionados pela produção das vacinas de subunidades em microrganismos. As vacinas de DNA, em teoria, representam uma metodologia que se aproxima da infecção natural, alcançando a indução da proteção desejada.

14 Vantagens cont. Produção em larga escala é bem mais barata, a manutenção do controle de qualidade é mais fácil, e a comercialização não necessita de uma rede de refrigeração, pois estas vacinas são estáveis à temperatura ambiente (facilitam o transporte e a distribuição). As técnicas de Biologia Molecular possibilitam a modificação de seqüências e a adição de epitotopos heterólogos a um dado antígeno: entender a relação entre a estrutura e função destes antígenos, incrementar a resposta imune induzida.

15 Animais e plantas transgênicos
Cabras geneticamente modificadas para produzir um antígeno de malária no leite. Bananas contendo vacinas contra hepatite e batatas contendo vacinas para cólera. Vacinas geneticamente incorporadas em alimentos vegetais e não necessitam de refrigeração, equipamentos de esterilização ou agulhas, custos reduzidos, fácil produção, riscos reduzidos de transmissão de outras doenças por equipamentos e materiais contaminados.

16 Pesquisas em desenvolvimento
Glicoproteína B (gB ) do citomegalovírus humano (CMV), em plantas de arroz. Um gene manipulado in vitro permite que essa proteína seja produzida e armazenada no grão. A produção do antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HbsAg) foi obtida em plantas e vacinas orais estão sendo utilizadas em testes clínicos com humanos desde 1997 contra Escherichia coli enterotoxigênica. Plantas transgênicas de fumo estão sendo desenvolvidas para a produção de vacinas para o controle da hepatite B, cárie dental, malária e o vírus da Influenza. AIDS, linfoma, melanoma, infecção pelo herpesvírus.

17 Biossegurança Existe um risco potencial da integração da vacina de DNA no genoma da célula do indivíduo, que pode causar ativação de oncogenes ou inibição de genes supressores de tumor. Entretanto, não existem evidências de que as vacinas gênicas possam apresentar riscos superiores aos desencadeados pelo uso das vacinas convencionais. Na realidade, foi demonstrado que a probabilidade de uma mutação ocorrer em um dado gene devido a imunização gênica seria de vezes menor do que a freqüência de mutação espontânea que ocorre no genoma das células dos mamíferos.

18 Biossegurança Exposição do sistema imune a níveis constitutivos de antígenos durante o período de expressão do gene. A apresentação constitutiva de um antígeno pode ter conseqüências desastrosas, como indução de tolerância e auto-imunidade. Nenhuma evidência destes fenômenos foi comprovada, e testes rigorosos devem ser feitos para que se possa passar dos modelos experimentais para o homem.

19 Principais Vias de administração
Injeção direta de DNA no músculo. Biobalística – pequenas quantidades de DNA (< 1mg), mais do que cem vezes menos material biológico quando comparado com a injeção direta no músculo (em torno de 100mg). Lipossomos.

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21 As microesferas de ácido lático e ácido glicólico, após o preparo (A) e após a liberação do antígeno encapsulado (B).(barra= 5 micrômetros)

22 Níveis totais de IgG anti-b-galactosidase determinados por ELISA nos soros de camundongos BALB/c imunizados com os plasmídeos pCMV (grupo-controle) e pCMV-bgal pelos métodos da biobalística, injeção direta no músculo e através do uso de lipossomos.

23 Modo de ação O plasmídeo penetra no núcleo da célula hospedeira sem se incorporar ao genoma desta. A vacina de DNA pode atuar de duas maneiras distintas: 1 – O metabolismo da célula hospedeira propicia a transcrição desse DNA exógeno. O mRNA produzido pela transcrição é traduzido no antígeno protéico. Este antígeno é degradado no citoplasma em peptídeos que se ligam às moléculas de MHC de classe I, formando um complexo que é transportado via Golgi para a superfície celular onde poderá ser reconhecido por linfócitos T citotóxicos. 2 – O antígeno é fagocitado e degradado pelo fagossomo em peptídeos que se conjugarão às moléculas de MHC de classe II. Estes complexos também são apresentados na superfície celular, podendo ativar linfócitos T auxiliares. dependendo do tipo de linfócito T estimulado, células B podem ser ativadas induzindo a produção de anticorpos. A célula B pode ser ativada também pela interação direta com o antígeno secretado ou liberado no meio.

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26 Vacinas de DNA multivalentes
Vacina tríplice viral (sarampo, cachumba e rubéola), a tríplice bacteriana (difteria, coqueluche e tétano), vacinas multivalentes contra meningites meningocócicas e pneumonia pneumocócica. Infelizmente a estratégia não é universal e algumas limitações não puderam ser superadas. Vacinas de DNA mostram grande potencial para a elaboração de formulações multivalentes.

27 Estratégias É possível inserir em um mesmo plasmídeo, ou em plasmídeos diferentes, vários genes que codifiquem para antígenos oriundos de um mesmo patógeno ou de patógenos diferentes. Vacinas baseadas em mistura de plasmídeos. Vacinas baseadas em politopos ou minigenes. Vacinas que codificam proteínas híbridas.

28 Cada um dos genes x e y são clonados em diferentes plasmídeos e inoculados juntos na mesma formulação. As proteínas expressas são processadas individualmente e apresentadas ao sistema imune por moléculas de MHC.

29 Regiões de genes que codificam epitopos específicos para linfócitos T citotóxicos, B ou T auxiliares (T, B, Th; na figura) são clonados na mesma fase de leitura em um único plasmídeo. Após a inoculação do plasmídeo no hospedeiro, o minigene expresso é processado e os epitopos são apresentados ao sistema imune por moléculas de MHC.

30 Genes que codificam para proteínas inteiras ou somente domínios imunologicamente importantes são clonados na mesma fase de leitura, em um único plasmídeo. Após a inoculação do plasmídeo no hospedeiro, a proteína híbrida é processada e apresentada ao sistema imune por moléculas de MHC.