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Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila.

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Apresentação em tema: "Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila."— Transcrição da apresentação:

1 Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila completamente sequenciado Grande numero de programas de sequenciamento aleatorio de sequencias (EST) Expressas está em andamento em vários diferentes organismos e espécies Fatos: - Barateamento do preço dos sequenciamento Revolução da pesquisa na área de ciências biológicas Quando?Década de 90 Porque? Universalização e desenvolvimento das técnicas de DNA recombinante Desenvolvimento de novas tecnologias para sequenciar DNA e proteinas - Sequenciamento do genoma humano proximo de seu termino - Genoma do camundongo completamente sequenciado

2 Consequências atuais - Grande quantidade de informação disponível - Formação de grandes consórcios de pesquisa: Projeto Análise científica mais holística Consequências futuras: - Predição dos fenótipos que resultariam de mudancas genéticas específicas - Identificar quais mudanças genéticas poderiam acelerar a domesticação de espécies selvagens Facilitar a manipulacao genética que garantiria a manutenção e expansão das bases de germoplasma Descrição dos mecanismos responsáveis pela heterose; habilidade de utilizar este fenômeno mais efetivamente Melhor compreensão da base genética da plasticidade fenotípica Caracterização do grupo mínimo de genes para o funcionamento de um organismo Compreensão da base genética da evolução::: melhor compreensão da diversidade da vida na terra Compreensão das interações entre os organismos e seu ambiente a nível de ecosistema

3 Montagem de uma combinação de genótipos em plantas transgênicas Estudos genéticos Testes funcionais Estudos de expressão in situ Estudos das interações Clonagem e sequênciamento Data mining Posição no mapa gen. ou físico; Baseado na inserção de sequência alvo Estratégia de Genoma funcional: Ex: tolerância a estresses abióticos Descoberta de genes Homologia como critério para identificar genes em bancos de sequências EST e genômicas Estudo expressão gênica em larga escala cDNA macro/microarrays; genechips Seleção de mutantes EMS, radiação, T-DNA, transposons Criação e análise de um banco de dados Complementação leved. Mutante em Arabidopsis Superexpressão Antisenso. Supressão por RNAi Sistema duplo-hibrido de leveduras Phage display Interação in vitro (crom. Afinidade, imunoprecipitação Alelismo Aditividade Epistasia Supressão Fusão proteína com GFP Expressão GFP ou luciferina com o promotor Construção de modelos de controle dos processos envolvidos Modificação de plantas de interesse agrícola baseados nesses modelos: modificação simultânea da expressão de vários genes

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5 Transcriptoma: Análise dos níveis de RNA de varios genes simultaneamente Um genoma possui varios transcriptomas …varios transcriptomas temporais Ex: tempo apos sujeicao a um estresse Ex: tempo apos uma determinada fase do desenvolvimento …varios transcriptomas espaciais Ex: transcriptoma celular-especifico Ex: transcriptoma tecido-especifico Ex: transcriptoma orgao-especifico

6 Etapas para a realizacao de um transcriptoma

7 1) Filme Macroarray.mov 2) Filme oligochip.mov

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9 Isolamento de DNA do banco de cDNA 1 a Etapa de um transcriptoma Preparacao do Micro/Macroarranjo (Micro/macroarray)

10 2 a Etapa de um transcriptoma: produção da sonda Duração do protocolo: 5 horas

11 2 a Etapa de um transcriptoma: hibridação

12 3 a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem Typhoon: Fosforescência,quimioluminescência; fluorescênica DNA alvo imobilizado: cDNA do genótipo tolerante Sonda marcada com o fluorocromo verde: genótipo tolerante na ausência do estresse Sonda marcada com o fluorocromo vermelho: genótipo tolerante na presença do estresse Gene com reduzida expressão na presença do estresse Gene expressão acentuada na presença do estresse Genes sem alteração na expressão a b d Nível de expressão na presença do estresse: a)+ x% b)+ y% (y>x) c)-z%

13 3 a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem

14 Descoberta da função de genes desconhecidos Análise da homologia das sequências Análise da biologia molecular do gene: co-regulação? Confirmação pela genética reversa 6626 genes alvos 19 sondas 197 genes orgão-específicos raiz=64 folha=94 flor=36 influorescencia=3 Matriz da expressão nos orgaos Analise da abundância do transcrito Agrupamento de expressão global Exemplo de data mining Agrupamento Dinamica da expressao Identificação de sequências regulatórias Caracterizacao gene/rota 347 genes constitutivos 5247 genes alvos sondas: 5 pontos temporais 8300 genes alvos Sondas: folha =6 raizes=4 flores=2 Siliqua=3 Influorescencia=2 Plantula=2 Zhu et al. (2001) Plant Physiol Biochem 39,

15 Exemplos de análise dos dados de um transcriptoma Análise de agrupamento da expressão de fatores transcripcionais na resposta a diferentes estresses ambientais em Arabidopsis Comparação dos transcriptomas na presença de dois diferentes estresses

16 Análise de Grupos: 2 genótipos Genótipo sensível ao estresse salino: IR29 (direita) Genótipo tolerante ao estresse salino: Pokkali (esquerda)

17 Comparação de diferentes transcriptomas temporais durante um processo celular

18 Diferentes Transcriptomas de genes que responde a estresses abióticos Classe 1: genes da rota de transdução de sinal à estresses abióticos associada ao f ator transcripcional DREB1A Classe 2: genes da rota de transdução de sinal à estresses abióticos independente do f ator transcripcional DREB1A

19 Confirmação dos resultados do transcriptoma: análise por Northern Blot

20 Classes de genes afetadas pelo estresse salino

21 Análise de grupos: Transcriptomas da resposta a patógeno Sonda 1e 2: Mutantes na síntese de ácido salicílico Sonda 3: Mutantes na síntese de ácido jasmônico Sonda 4: Mutantes na síntese do etileno DNA alvo: fatores transcricionais do genoma de Arabidopsis

22 Kits completos com microarranjos com oligonucleotideos e sonda de referencias Vantagens: oligonucleotideos escolhidos baseados em regioes com baixa homologia a outros genes - estringencias das pos-lavagens pode ser maior: menor nivel de hibridizacao cruzada

23 Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic and cold stress 8100 genes (Genechip) Genes > 2x = Total 2678 Genes Controle Meio Fresco 741 genes 4oC4oC 2086 genes 58% 42% Manitol (200 mM) NaCl (100 mM) 1123 genes 46%53% 1008 genes Raízes: 3 horas após NaCl Manitol 4oC4oC

24 Folhas: 3 horas após NaCl Manitol 4oC4oC Raízes: 3 horas após NaCl Manitol 4oC4oC

25 Raízes: 27 horas após NaCl Manitol 4oC4oC Folhas: 27 horas após NaCl Manitol 4oC4oC Folhas: 3 horas após NaCl Manitol 4oC4oC Raízes: 3 horas após NaCl Manitol 4oC4oC

26 Raízes: Sobreposição entre 3 e 27h NaCl Manitol 4oC4oC Folhas: Sobreposição entre 3 e 27h NaCl Manitol 4oC4oC Estresse salino: sobreposição 3-27 h na raiz Estresse por frio: sobreposição 3-27h

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28 Estresses regula a expressão de mais de 370 genes cuja função é totalmente desconhecidaÇ Pistas: especificidade de tecido e regulação por múltiplos estresses: CBF1 e ABA2 sim folha, não raiz Maioria das mudanças são estimulo-específicas: sob. De 5% e 0,5% (3-27h) 200 mM Manitol=100 mM NaClÇ 40% sobreposição foi observada em folhas (sem contato) Frio alterou 2 vezes mais a expressão gênica do que os outros estresses Mais induzido gene ELIP: liga a chl a Maioria das sobreposições foram específicas à folhas ou raízes Sobreposições podem ser perdidas em experimento que examina um limitado número de pontos temporais ou ignora as diferenças tecido-específicas 3 -> 27h: redução em 4 vezes nas respostas comuns: respostas mais específicas a cada estresse se seguem após o choque inicial Transcriptoma do estresse ao frio: movimento para um novo e diferente steady-state Raízes e folhas apresentam diferentes modificações no seu transcriptoma para cada estresse: ExÇ 86% das mudanças induzidas pelo frio não são compartilhadas entre folhas e raízes Maioria 2409 genes reg. pelo estresse: não tem seq tipicas dos fat. transc. CBF1 e DREB1: a)Presença de outros elementos importantes nas sequências dos promotores b)Um grande número de mudanças podem ser causadas por diferenças na estabilidade do RNA ao invés da reg transc.

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30 Segregacao alelica Transcriptoma Caracteriz. do fenotipo Proteoma Caracteriz. do genotipo Identificacao de genotipos tolerantes e susceptiveis Transcriptoma e proteoma Identificacao de genes e proteinas associados a tolerancia Mapeamento de populacoes QTLLocus genico candid.Locus quant. transcritoLocus quant. proteinaMapa genetico Identificacao de genes/marcadores ligados a tolerancia Selecao assistida por marcadores Transformacao Melhoramento molecular

31 Sugestao de proposta para elaboracao de projeto genoma funcional na UFV: 1) transcriptoma Em colaboracao: Instituto de Quimica USP Embrapa-Cenargem Unicamp UNESP-Araraquara Realizado na UFV

32 Múltiplas repetições : teste de repetibilidade: anãlise estatística : seq. diferentes Melhores resultados

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