Pesquisas em genoma funcional

Apresentação em tema: "Pesquisas em genoma funcional"— Transcrição da apresentação:

1 Pesquisas em genoma funcional
“Revolução” da pesquisa na área de ciências biológicas Quando? Década de 90 Porque? Universalização e desenvolvimento das técnicas de DNA recombinante - Barateamento do preço dos sequenciamento Desenvolvimento de novas tecnologias para sequenciar DNA e proteinas Fatos: - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila completamente sequenciado - Genoma do camundongo completamente sequenciado - Sequenciamento do genoma humano proximo de seu termino Grande numero de programas de sequenciamento aleatorio de sequencias (EST) Expressas está em andamento em vários diferentes organismos e espécies

2 Melhor compreensão da base genética da plasticidade fenotípica
Consequências atuais - Grande quantidade de informação disponível - Formação de grandes consórcios de pesquisa: Projeto 2010 - Análise científica mais holística Consequências futuras: - Predição dos fenótipos que resultariam de mudancas genéticas específicas - Identificar quais mudanças genéticas poderiam acelerar a domesticação de espécies selvagens Facilitar a manipulacao genética que garantiria a manutenção e expansão das bases de germoplasma Descrição dos mecanismos responsáveis pela heterose; habilidade de utilizar este fenômeno mais efetivamente Melhor compreensão da base genética da plasticidade fenotípica Caracterização do grupo mínimo de genes para o funcionamento de um organismo Compreensão da base genética da evolução::: melhor compreensão da diversidade da vida na terra Compreensão das interações entre os organismos e seu ambiente a nível de ecosistema

3 Estudo expressão gênica em
Estratégia de Genoma funcional: Ex: tolerância a estresses abióticos Descoberta de genes Estudo expressão gênica em larga escala Seleção de mutantes Homologia como critério para identificar genes em bancos de sequências EST e genômicas EMS, radiação, T-DNA, transposons cDNA macro/microarrays; genechips Clonagem e sequênciamento Data mining Posição no mapa gen. ou físico; Baseado na inserção de sequência alvo Criação e análise de um banco de dados Estudos das interações Testes funcionais Sistema duplo-hibrido de leveduras Estudos genéticos Complementação leved. Phage display Interação in vitro (crom. Afinidade, imunoprecipitação Mutante em Arabidopsis Estudos de expressão in situ Superexpressão Alelismo Aditividade Antisenso. Epistasia Fusão proteína com GFP Supressão por RNAi Supressão Expressão GFP ou luciferina com o promotor Montagem de uma combinação de genótipos em plantas transgênicas Construção de modelos de controle dos processos envolvidos Modificação de plantas de interesse agrícola baseados nesses modelos: modificação simultânea da expressão de vários genes

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5 Um genoma possui varios transcriptomas
Análise dos níveis de RNA de varios genes simultaneamente Um genoma possui varios transcriptomas …varios transcriptomas temporais Ex: tempo apos sujeicao a um estresse Ex: tempo apos uma determinada fase do desenvolvimento …varios transcriptomas espaciais Ex: transcriptoma celular-especifico Ex: transcriptoma tecido-especifico Ex: transcriptoma orgao-especifico

6 Etapas para a realizacao de um transcriptoma

7 1) Filme Macroarray.mov 2) Filme oligochip.mov

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9 Preparacao do Micro/Macroarranjo
1a Etapa de um transcriptoma Isolamento de DNA do banco de cDNA Preparacao do Micro/Macroarranjo (Micro/macroarray)

10 2a Etapa de um transcriptoma: produção da sonda
Duração do protocolo: 5 horas

11 2a Etapa de um transcriptoma: hibridação

12 Nível de expressão na presença do estresse:
3a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem Typhoon: Fosforescência,quimioluminescência; fluorescênica DNA alvo imobilizado: cDNA do genótipo tolerante Sonda marcada com o fluorocromo “verde”: genótipo tolerante na ausência do estresse Sonda marcada com o fluorocromo “vermelho”: genótipo tolerante na presença do estresse Gene com reduzida expressão na presença do estresse a b d Gene expressão acentuada na presença do estresse Nível de expressão na presença do estresse: + x% + y% (y>x) -z% Genes sem alteração na expressão

13 3a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem
1 5 1 2 3 4

14 Exemplo de data mining Descoberta da função de genes desconhecidos
5247 genes alvos sondas: 5 pontos temporais 6626 genes alvos 19 sondas Agrupamento Dinamica da expressao Caracterizacao gene/rota Descoberta da função de genes desconhecidos Análise da homologia das sequências Análise da biologia molecular do gene: co-regulação? Confirmação pela genética reversa 197 genes orgão-específicos raiz=64 folha=94 flor=36 influorescencia=3 Identificação de sequências regulatórias Matriz da expressão nos orgaos Analise da abundância do transcrito Agrupamento de expressão global 347 genes constitutivos 8300 genes alvos Sondas: folha =6 raizes=4 flores=2 Siliqua=3 Influorescencia=2 Plantula=2 Zhu et al. (2001) Plant Physiol Biochem 39,

15 Comparação dos transcriptomas na presença de dois diferentes estresses
Exemplos de análise dos dados de um transcriptoma Análise de agrupamento da expressão de fatores transcripcionais na resposta a diferentes estresses ambientais em Arabidopsis Comparação dos transcriptomas na presença de dois diferentes estresses

16 Análise de Grupos: 2 genótipos
Genótipo sensível ao estresse salino: IR29 (direita) Genótipo tolerante ao estresse salino: Pokkali (esquerda)

17 Comparação de diferentes transcriptomas temporais durante um processo celular

18 Diferentes Transcriptomas de genes que responde a estresses abióticos
Classe 1: genes da rota de transdução de sinal à estresses abióticos associada ao f ator transcripcional DREB1A Classe 2: genes da rota de transdução de sinal à estresses abióticos independente do f ator transcripcional DREB1A

19 Confirmação dos resultados do transcriptoma: análise por Northern Blot

20 Classes de genes afetadas pelo estresse salino

21 Análise de grupos: Transcriptomas da resposta a patógeno
DNA alvo: fatores transcricionais do genoma de Arabidopsis Sonda 1e 2: Mutantes na síntese de ácido salicílico Sonda 3: Mutantes na síntese de ácido jasmônico Sonda 4: Mutantes na síntese do etileno

22 Kits completos com microarranjos com oligonucleotideos e sonda de referencias
oligonucleotideos escolhidos baseados em regioes com baixa homologia a outros genes Vantagens: - estringencias das pos-lavagens pode ser maior: menor nivel de hibridizacao cruzada

23 Genes > 2x = Total 2678 Genes
Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic and cold stress 8100 genes (Genechip) Genes > 2x = Total 2678 Genes Controle Meio Fresco 741 genes 4oC 2086 genes 58% 42% Manitol (200 mM) NaCl (100 mM) 1123 genes 46% 53% 1008 genes 375

24 120 375

25 87 59 120 375

26 Estresse por frio: sobreposição 3-27h
Estresse salino: sobreposição 3-27 h na raiz 22 5

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28 Mais induzido gene ELIP: liga a chl a
Maioria das mudanças são estimulo-específicas: sob. De 5% e 0,5% (3-27h) 200 mM Manitol=100 mM NaClÇ 40% sobreposição foi observada em folhas (sem contato) Frio alterou 2 vezes mais a expressão gênica do que os outros estresses Mais induzido gene ELIP: liga a chl a Maioria das sobreposições foram específicas à folhas ou raízes Sobreposições podem ser perdidas em experimento que examina um limitado número de pontos temporais ou ignora as diferenças tecido-específicas 3 -> 27h: redução em 4 vezes nas respostas comuns: respostas mais específicas a cada estresse se seguem após o choque inicial Transcriptoma do estresse ao frio: movimento para um novo e diferente “steady-state” Raízes e folhas apresentam diferentes modificações no seu transcriptoma para cada estresse: ExÇ 86% das mudanças induzidas pelo frio não são compartilhadas entre folhas e raízes Estresses regula a expressão de mais de 370 genes cuja função é totalmente desconhecidaÇ Pistas: especificidade de tecido e regulação por múltiplos estresses: CBF1 e ABA2 sim folha, não raiz Maioria 2409 genes reg. pelo estresse: não tem seq tipicas dos fat. transc. CBF1 e DREB1: Presença de outros elementos importantes nas sequências dos promotores Um grande número de mudanças podem ser causadas por diferenças na estabilidade do RNA ao invés da reg transc.

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30 Melhoramento molecular
Identificacao de genotipos tolerantes e susceptiveis Transcriptoma e proteoma Identificacao de genes e proteinas associados a tolerancia Mapeamento de populacoes Segregacao alelica Transcriptoma Caracteriz. do fenotipo Proteoma Caracteriz. do genotipo QTL Selecao assistida por marcadores Identificacao de genes/marcadores ligados a tolerancia Melhoramento molecular Locus genico candid. Locus quant. transcrito Locus quant. proteina Transformacao Mapa genetico

31 Instituto de Quimica USP
Sugestao de proposta para elaboracao de projeto genoma funcional na UFV: 1) transcriptoma Em colaboracao: Instituto de Quimica USP Embrapa-Cenargem Unicamp UNESP-Araraquara Realizado na UFV

32 Múltiplas repetições : teste de repetibilidade: anãlise estatística : seq. diferentes
Melhores resultados

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