Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012

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1 Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012
Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Últimas notícias do “El Dorado” das células pluripotentes induzidas (iPS’s) Júri: Prof. Fernando Capela Prof. Paulo de Oliveira O nosso trabalho destina-se a falar das mais recentes técnicas de reprogramação de células em células iPSs, que poderão potencializar certas terapias Explicar conceitos importantes Elaborado por: Maria Ferreira nº 27496 Mariana Ascensão nº 27756 Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012

2 Diferenciar em células especializadas
“Stem Cells” Diferenciar em células especializadas Autorrenovar Células indiferenciadas - Células indiferenciadas capazes de se dividir e diferenciar em células especializadas ou de se autorrenovar. - 2 fontes: embrião (na fase de blastocisto) e tecidos adultos (encontradas em tecidos responsáveis pela regeneração tecidual) Embrião 2 Fontes Tecidos adultos

3 “Stem Cells” De acordo com o tipo de células que podem gerar dividem-se em: Totipotentes Pluripotentes Multipotentes Oligopotentes Unipotentes Figura 1 – “Stem cells” pluripotentes - Destacar as pluripotentes pois é delas que vamos falar. - As stem cells pluripotentes podem produzir qualquer célula do embrião exceto os anexos embrionários

4 Células iPS “Stem cells” pluripotentes derivadas artificialmente de células não-pluripotentes pela indução de uma manifestação “forçada” de certos genes Não são obtidas a partir do embrião, mas sim de células diferenciadas iPS são semelhantes às stem cells embrionárias mas não são obtidas a partir do embrião - São obtidas a partir das próprias células adultas do paciente.

5 História das células iPS
Yamanaka (2006) – 1ª vez que se geraram iPSCs a partir de fibroblastos de ratinhos Foram isolados 4 genes essenciais para a produção de “stem cells” Yamanaka (2007) – descobriu que: Nanog um dos principais determinantes da pluripotência celular c-Myc é oncogénico O fibroblasto é a célula constituinte do tecido conjuntivo e são responsáveis pela regeneração e estão também envolvidos na produção de fatores de crescimento Foram isolados 4 genes essenciais para a produção de stem cells – Oct3/4, Sox2, c-Myc e Klf4 – passando a designar-se fatores de Yamanaka (4TF – 4 fatores de transcrição) - O c-Myc é oncogénico mas podem criar-se iPSCs sem c-Myc (processo + lento e – eficaz), mas iremos abordá-lo + à frente

6 História das células iPS
Yamanaka (2007) – transformou fibroblastos humanos em células iPS’s Hochedlonger (2008) - utilizou um adenovírus para transportar os 4TF para o DNA de célula da pele e fígado de ratinhos Yamanaka (2008) - concluiu que se poderiam transferir os 4 genes necessários com um plasmídeo O adenovírus é único relativamente aos outros vetores como o vírus e o retrovírus, pois não incorpora quaisquer dos seus próprios genes no hospedeiro alvo, evitando a possível inserção mutagénica Plasmídeo: o método evita vírus mas são na mesma necessários oncogenes para que se realize a reprogramação e é um método menos eficiente Figura 2 - Yamanaka

7 História das células iPS
Freed (2009) – demonstrou outra vantagem do adenovírus Morrisey (2011) – usou microRNAs, melhorando a eficiência da reprogramação Vantagem do adenovírus – necessita de pouco tempo até que se dê a reprogramação

8 Produção de células iPS
Células para reprogramação: Eficácia, período de tempo e extensão da reprogramação varia conforme as células iniciais Tecidos da medula óssea são uma fonte de “stem cells” Cirurgia invasiva e dolorosa

9 Produção de células iPS
1- As células do dador são isoladas e cultivadas 2- Transferem-se os genes indutores das stem cells (4TF) para as células do dador por meio de vetores virais. As células vermelhas indicam as células que manifestam os genes introduzidos. 3- Transferência para uma cultura de células de suporte mitoticamente inativadas 4- Um pequeno subgrupo dessas células produzem colónias de stem cells. Figura3 – Indução de iPSC’s

10 Produção de células iPS
Células Adultas Geração de iPSC Células adultas podem ser reprogramados para um estado pluripotente pela expressão “forçada” de alguns fatores embrionários de transcrição - A geração de iPSCs a partir de células adultas, demonstra que as células de mamíferos adultos podem ser reprogramados para um estado pluripotente pela expressão forçada de alguns fatores embrionários de transcrição.

11 Produção de células iPS
Eficiência da produção extremamente baixa Se forem usados vírus poderá haver alteração genética das células e a expressão de oncogenes pode ser acionada iPSC’s são tipicamente derivadas por transfecção de certas células Utilização de vírus – abordados + a frente Transfecção - processo de introdução de DNA em células de forma intencional mediada por um vírus Transfecção – conseguida através de vetores virais, como os retrovírus. Os genes transfectados incluem os reguladores transcricionais mestres, que vão ser abordados mais à frente. Esta técnica está a tornar-se menos popular, uma vez que é conhecida por ter tendência a induzir tumores. Exemplo: Fibroblastos

12 Influência do estado de diferenciação das células
O estado de diferenciação da célula alvo influencia a sua suscetibilidade para a reprogramação e para o potencial de diferenciação das iPSC’s daí derivadas Stem cells de músculo de rato reprogramam com maior eficiência que as suas células filhas mais diferenciadas (mioblastos e fibroblastos) Geração eficiente de células iPS a partir de células-tronco musculares A reprogramação de células adultas em stem cells é pouco eficiente. O estado de diferenciação da célula alvo influencia a sua suscetibilidade para a reprogramação, e o potencial de diferenciação das células iPS que daí são derivadas. Foi avaliada (reprogramação 2ª geração) a reprogramação em stem cells e populações de células maduras que residem no músculo-esquelético. As células estaminais encontradas no músculo do rato, incluindo as células satélites residentes e progenitoras mesenquimais, reprogramam com eficiência significativamente maior do que as suas filhas mais diferenciadas (mioblastos e fibroblastos). Em contraste, não há evidência de potencial de diferenciação parcial entre as células derivadas de células iPS miogenicamente comprometidas. Stem cells adultas reprogramam de forma mais eficiente do que as células diferenciadas. "A memória epigenética" influenciam o potencial de diferenciação das células iPS derivadas de diferentes linhagens de células somáticas no músculo esquelético. Discussão SMPs (percursores) e progenitores mesenquimais SCA1 + reprogramam para gerar células iPS com maior eficiência do que células diferenciadas CXCR4 sugerindo que a pluripotência pode ser induzida de forma mais eficiente em stem cells que nos seus descendentes mais diferenciados que residem no mesmo local anatómico e na mesma linhagem de desenvolvimento. O aumento da susceptibilidade para reprogramação pode ser um atributo a muitas stem cells adultas. Há um grande impacto no estadio de diferenciação na eficiência da reprogramação, e muita da eficiência pode ser obtida através da selecção de um alvo apropriado, utilizando células precursoras indiferenciadas como alvos para reprogramação substancialmente aumenta a eficiência da geração de iPS. Apesar de alguma memória epigenética da célula adulta de origem, SMP iPS não apresentam propriedades miogénicas na sua diferenciação em ensaios de teratoma, avaliada tanto pela análise histológica como western blotting, para marcadores de linhagem específica de diferenciação. Similarmente, embora células SCA1 + serem uniformemente não-miogénicas in vivo e in vitro, as células iPS geradas a partir de células SCA1 + se diferenciam para formar músculo esquelético tão eficientemente quanto PMS iPS. Curiosamente, células derivadas mesangioblastos iPS (MAB-iPS) geram teratomas contendo até 70% do músculo estriado. Diferenças entre estes resultados podem reflectir diferenças no grau de especificação da linhagem entre estes dois tipos de células, como mesangioblastos têm sido relatados para reter tanto a capacidade de diferenciação miogênica como não-miogênica (incluindo a capacidade de diferenciar para formar endotélio, fibroblastos, osso, gordura, cartilagem e células neurais), enquanto SMPs representam linhagem de stem cells musculares comprometidas. As células de origem são apenas uma das muitas possíveis influências sobre o potencial de diferenciação das células iPS derivadas de células somáticas distintas, e podem refletir uma incompatibilidade do programa miogênico com pluripotência que podem ajudar a explicar dificuldades encontradas em tentativas para dirigir a diferenciação destas células ao longo da linhagem músculo esquelético.

13 Genes utilizados para a indução
Genes de indução Geração de iPSC’s Genes utilizados para a indução depende Reguladores transcricionais cruciais envolvidos no processo de indução, cuja ausência torna impossível a indução Oct-3/4 Sox2 Foram identificados reguladores transcricionais cruciais ao processo de indução. Sem eles seria impossível existir indução

14 Transferência dos 4TF, exceto
Genes de indução Fatores adicionais para ↑ eficiência da indução: Klf4 c-Myc Nanog LIN28 Transferência dos 4TF, exceto c-Myc oncogénico Assim, foram selecionados quatro genes principais essenciais para a produção de stem cells: Oct-3/4, Sox2, c-Myc e Klf4 C-Myc – infelizmente é oncogénico Num estudo posterior, Yamanaka relatou que pode criar iPSCs mesmo sem c-myc; o processo leva mais tempo e não é tão eficiente, mas as quimeras resultantes não desenvolvem cancro Células Adultas Células iPS Processo: + lento - eficaz Não se desenvolve cancro

15 Genes de indução Oct-3/4 Sox2 Klf4
Papel crucial na manutenção da pluripotência Ausência → conduz à diferenciação Sox2 Semelhante ao Oct-3/4 → mantém pluripotência Expresso em “stem cells” pluripotentes e unipotentes Klf4 fator capaz de gerar células iPS

16 Genes de indução c-Myc Nanog LIN28
Mostrou-se desnecessários para a geração de iPSC’s humanas Oncogene → por isso o seu uso é preocupante Nanog Necessário para promover pluripotência Poder de renovar “stem cells” Ausência → rápida diferenciação Desnecessário para a indução LIN28 Fator de geração de iPSC’s Desnecessário

17 Inicia-se a diferenciação de “stem cells” em células adultas
p53 Proteína supressora de tumores Principal inibidora da geração de células iPS Liga-se diretamente ao promotor do Nanog para suprimir o seu nível de expressão Falar de 2 proteínas importantes na criação de iPSCs Inicia-se a diferenciação de “stem cells” em células adultas Deleção do gene p ↑ eficiência de geração de iPSCs em 1000x

18 p73 Proteínas envolvida na geração de células iPS humanas
Possui 2 promotores alternativos: TAp funções semelhantes à p53 DNp inibe o p53 e o p73 ↑a expressão Nanog Da família da p53 TAp73 – transativação de p73 DNp73 – N terminal do p3 é eliminado pode ↑ eficiência da geração de iPSC’s humanas células geradas com a sua expressão são + resistentes à diferenciação (in vitro e in vivo)

19 DNp73 Os 2 promotores da p73 têm papéis opostos
Lin et al descobriu que a adição do gene humano de DNp73 ↑ a geração de iPSC’s Condições basais: Oct-3/4 Sox 2 Klf4 c-Myc Como já referi, o p53 e o seu ciclo celular são os principais inibidores da geração de iPSCs humanas. Vantagem do DNp73: a adição do seu gene aumenta a geração de iPSC’s em comparação com as células submetidas apenas às condições basais Condições basais + DNp73 Gráfico 1 – Colónias de iPSC humanas

20 Manutenção da pluripotência
DNp73 Contribui diretamente para a expressão do Nanog e do Oct-3/4 - Ainda relativamente aos estudos de Lin - DNp73 contribui para a expressão do Nanog, como já tinha sido visto Manutenção da pluripotência Gráfico 2 – Expressão de fatores de transcrição

21 Proteínas recombinantes
Até 2009, todos os métodos desenvolvidos envolviam a utilização de materiais genéticos Possibilidade de ocorrerem modificações genéticas Tumores - Para combater esses métodos, Hogyan relatou a geração de piPSCs (stem cells pluripotentes induzidas por proteínas) Hongyan et al Utilizaram proteínas recombinantes capazes de reprogramação celular piPSC’s

22 Proteínas recombinantes
Hongyan et al Autorrenovam-se Pluripotentes in vitro e in vivo piPSC’s - Para gerar proteínas recombinantes que podessem atravessar a membrana plasmática de células somáticas foi concebida e fundida proteína de fusão contendo um domínio de transdução poli-arginina (exemplo: 11R – 11 argininas) ligado ao terminal C de cada um dos 4 fatores de reprogramação: Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc (Fig. S1A). Evitam introdução de modificações genéticas

23 Proteínas recombinantes
piPSC’s Foram criadas em ratinhos Indistinguíveis das “stem cells” embrionárias Exigem métodos de aperfeiçoamento Representa um avanço em relação aos outros métodos Vantagens piPSCs morfologicamente indistinguíveis das “stem cells” embrionárias Métodos de aperfeiçoamento, incluindo resolução para a baixa eficiência De seguida vou falar das vantagens que este método apresenta

24 Proteínas recombinantes
Vantagens: Elimina o risco de modificar o genoma da célula-alvo Oferece um método para gerar iPSC’s + seguras Confere uma abordagem + simples e + rápida Poderia potencialmente permitir a aplicação de uma metodologia de reprogramação mais ampla e mais económica produção de proteína recombinantes em larga escala

25 Obstáculos Reduzido número de células Falta de metodologias simples
Custos Rendimento Inserção genómica Rejeição Imunológica Teratomas

26 Vetores Alternativos Plasmídeos – evita vírus, necessita de oncogenes e é menos eficiente Adenovírus – não incorpora os seus genes no hospedeiro alvo e necessita de pouco tempo de apresentação Proteínas recombinantes Protaínas recombinantes já foram referidas

27 Semelhanças entre iPSC’s e ‘stem cells’
Propriedades celulares biológicas: Morfologia – forma redonda, nucleótidos grandes e citoplasma escasso Propriedades de crescimento – tempo de duplicação e atividade mitótica Marcadores de stem cells - iPS humanas expressam os marcadores específicos para hESC, incluindo SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E e Nanog Genes de ‘stem cells’ – Oct-3/4, Sox2, Nanog, GDF3, REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4 e hTERT Atividade da telomerase – hESCs expressam alta atividade de telomerases para sustentar a autorrenovação e proliferação e assim como as iPS Vantagens, oportunidades e desafios das iPSCs • O desenvolvimento das iPS traz uma série de possíveis avanços que não poderiam ter sido obtidos através da utilização de células ES graças à sua plasticidade celular. • iPS não geram riscos de rejeição imune quando utilizadas terapeuticamente. • Possibilidade de modelos de doenças in vitro. • Permitem triagem individual de acordo com diferenças genómicas ajudando na progressão da doença ou até a determinar quais os agentes farmacológicos são ideais para cada indivíduo. • Possibilidade de reparação causadora de doenças por mutações, visando genes e outras tecnologias na transplantação. • A eficiência da indução de iPS é muito baixa e dando origem a células insuficientemente reprogramadas. • A caracterização da funcionalidade de células iPS derivadas de células somáticas e a sua equivalência funcional com homólogos in vivo precisa de ser demonstrada. • A evolução dentro do campo das células iPS e o futuro da terapia personalizada com “stem cells” vai permitir alterar as próprias células do paciente, corrigindo o alelo da doença e depois recolocando as células para o paciente em uma geneticamente e formato fisiologicamente correto.

28 Semelhanças entre iPSC’s e ‘stem cells’
Plutipotência: Diferenciação neural – iPS diferenciadas em neurónios, expressando βIII-tubulina, tirosina hidroxilase, AADC, DAT, Chat, LMX1B e MAP2 Diferenciação cardíaca – iPSC diferenciadas em cardiomiócitos Formação de teratomas Quimeras de ratinhos Complementação tetraploide - Medicina personalizada: • A tecnologia das iPS tem potencial para avançar com a terapia médica personalizada, a medicina regenerativa e criar novos modelos de doenças humanas para pesquisa e testes terapêuticos. • Antes deve-se avaliar a sua modelação de doenças, toxicidade de fármacos, descoberta de triagem / fármacos e terapia de reposição celular e potencial terapêutico. • Uso das células iPS para a terapia celular de doenças incuráveis: produção de células adultas específicas para cada paciente e doença específica, para uma futura aplicação clínica de desenvolvimento de medicamentos. • O transplante de órgãos é muito limitado devido à baixa disponibilidade de tecidos e à exigência de tratamento com imunossupressores. • As células iPS humanas podem potencialmente contornar esses problemas, porque poderiam ser induzidas em tipos de células desejadas que já estariam geneticamente compatíveis com o paciente. • O desenvolvimento de tecnologias em células iPS tem-nos ensinado muito sobre os mecanismos de regulação que determinam o estado da célula e bloqueia a plasticidade vital de construção de qualquer esforço para desenvolver classe de comutação (transformação de uma célula diferenciada de uma linhagem, numa célula de linhagem diferente). • Discussões sobre o fornecimento de terapias celulares em humanos começaram, mas devem continuar a fim de promover opções de tratamento seguras e funcional para pacientes com doenças debilitantes e distúrbios neurológicos. (Questão ética)

29 Vantagens e desafios das iPSC’s
Grande plasticidade celular Não geram riscos de rejeição imune Possibilidade de modelos de doenças in vivo Possibilidade de reparação de doenças por mutações A eficácia de indução de iPSC’s é muito baixa dando origem a células insuficientemente reprogramadas

30 Medicina personalizada
A tecnologia das iPS tem potencial para avançar com a terapia médica personalizada, a medicina regenerativa e criar novos modelos de doenças humanas para pesquisa e testes terapêuticos Uso de iPSC’s para a terapia de doenças incuráveis: produção de células adultas específicas para cada paciente e doença específica - Medicina personalizada: • A tecnologia das iPS tem potencial para avançar com a terapia médica personalizada, a medicina regenerativa e criar novos modelos de doenças humanas para pesquisa e testes terapêuticos. • Antes deve-se avaliar a sua modelação de doenças, toxicidade de fármacos, descoberta de triagem / fármacos e terapia de reposição celular e potencial terapêutico. • Uso das células iPS para a terapia celular de doenças incuráveis: produção de células adultas específicas para cada paciente e doença específica, para uma futura aplicação clínica de desenvolvimento de medicamentos.

31 Medicina personalizada
O transplante de órgãos exige disponibilidade de tecidos e tratamento com imunossupressores As iPSCs humanas poderiam ser induzidas nos tipos de células desejados e seriam geneticamente compatíveis com o paciente Surgiram discussões sobre o fornecimento de terapias celulares em humanos, nomeadamente para pacientes com doenças debilitantes e distúrbios neurológicos – Questão ética O transplante de órgãos é muito limitado devido à baixa disponibilidade de tecidos e à exigência de tratamento com imunossupressores. As células iPS humanas podem potencialmente contornar esses problemas, porque poderiam ser induzidas em tipos de células desejadas que já estariam geneticamente compatíveis com o paciente. O desenvolvimento de tecnologias em células iPS tem-nos ensinado muito sobre os mecanismos de regulação que determinam o estado da célula e bloqueia a plasticidade vital de construção de qualquer esforço para desenvolver classe de comutação (transformação de uma célula diferenciada de uma linhagem, numa célula de linhagem diferente). Discussões sobre o fornecimento de terapias celulares em humanos começaram, mas devem continuar a fim de promover opções de tratamento seguras e funcional para pacientes com doenças debilitantes e distúrbios neurológicos. (Questão ética)

32 Um futuro aberto É necessário superar a barreira que está entre a eficiência e a integração genómica. Caracterização proteómica de iPSC’s. Uso de iPSC’s para identificar fármacos terapêuticos capazes de resgatar um fenótipo. Por exemplo, linhas de células iPS derivadas de pacientes afetados pela síndrome de displasia ectodérmica (CEE), onde o gene p63 está mutado, exibem um compromisso epitelial anormal que poderia ser parcialmente resgatado. - Um futuro aberto É necessário superar a barreira que está entre a eficiência e a integração genómica. Métodos com integração de transgenes enfrentam problemas de reprogramação incompleta e formação de um tumor. A realização de uma caracterização proteómica de células iPS é uma outra estratégia. Uma experiência interessante pode tentar combinar o positivo dessas estratégias numa única técnica eficaz para a reprogramação de células em células iPS. Utilização de iPS para identificar drogas terapêuticas capazes de resgatar um fenótipo. Por exemplo, linhas de células iPS derivadas de pacientes afetados pela síndrome de displasia ectodérmica (CEE), em que o gene p63 está mutado, exibem um compromisso epitelial anormal que poderia ser parcialmente resgatada por um composto pequeno.

33 Potenciais aplicações das iPSC’s
Modelação de doenças Descoberta de fármacos Terapia genética Terapia de substituição/reprogramação Terapia para o Parkinson Terapia para reparação cardíaca Terapia para reparação hepática

34 Conclusões Estas técnicas de geração de células iPS são revolucionárias pois, anteriormente só se podiam obter células pluripotentes a partir do embrião e agora, é possível obtê-las a partir de células adultas. A eficiência das iPSC é muito baixa células insuficientemente rerogramadas

35 Conclusões A utilização de vírus pode levar a alterações genómicas
Reguladores transcricionais cruciais envolvidos no processo de indução, cuja ausência torna impossível a indução Importante descoberta para a terapêutica.

36 FIM

37 Biografia Lin et al. DNp73 improves generation efficiency of human induced pluripotent stem cells. BMC Cell Biology ; 13:9 TAN, Kah Yong et al. Efficient Generation of iPS Cells from Skeletal Muscle Stem Cells. PLoS ONE. Outubro 2011; vol. 6 ZHOU, Hongyan et al. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins. Cell Press. Maio 2009

38 Fonte das imagens Figura 1 - “Stem cells” pluripotenes em gnica.html Figura 2 – Yamanaka em 8 Figura 3 – Indução de iPSC’s em Gráfico 1- Colónias de iPSCs humanas em Lin et al. DNp73 improves generation efficiency of human induced pluripotent stem cells. BMC Cell Biology. 2012; 13:9 Gráfico 2 - Expressão de fatores de transcrição em Lin et al. DNp73 improves generation efficiency of human induced pluripotent stem cells. BMC Cell Biology. 2012; 13:9