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DNA Microarrays. O que é DNA Microarray? Também conhecido como chip de DNA Permite a medida do nível de transcrição de cada gene no genoma (expressão.

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1 DNA Microarrays

2 O que é DNA Microarray? Também conhecido como chip de DNA Permite a medida do nível de transcrição de cada gene no genoma (expressão dos genes) Transcrição? –Processo de cópia do DNA em RNA mensageiro –Dependente do meio Microarray detecta mRNA

3 O que é DNA Microarray? Cheung et al. 1999

4 Como fazer um microarray? Começa-se com genes individuais (p. ex. ~6,200 genes do genoma de fungos) Amplifica-se todos eles por PCR Spot todos em um meio, como por exemplo lâmina de vidro de microscopia. Cada spot tem 100 µm de diâmetro Spotting feito por um robô. Etapa complexa e crítica do processo.

5 Como fazer um microarray? Cheung et al. 1999

6 Exemplo Fungo Cresce em ambientes aeróbicos e anaeróbicos Diferentes genes serão ativados no intuito de se adaptar a cada ambiente. Extrai-se o mRNA Converter o mRNA em cDNA marcado com fluorescência

7 Exemplo Misturar o cDNA Hibridizar com a sonda Cada sequência hibridiza com o gene correspondente no array Lavar o cDNA não hibridizado Ler com laser Analisar a imagem

8 Brown & Botstein, 1999

9 Lendo um array O laser escaneia o array e produz imagens Um laser para cada cor (um para verde, outro para vermelho) Análise da imagem: –Supressão de background –Localização e detecção dos spots, incluindo a redução da intensidade de background, posição do spot e tamanho deste.

10 Lendo um array (cont.) BlockColumnRowGene Name RedGreenRed:Green Ratio 111tub12,3452, tub23,5892, sec14,1091, sec21,5003, sec31,2461, act11,9372, act22,5611, fus12,9623, idp23,5851, idp12,7961, idh12,1704, idh21,8962, erd11,0233, erd21,6982,

11 Real DNA Microarray

12 Y-fold –Fold – quantas vezes –Expressão como repressão ou indução Y-fold –Calculado como o inverso da razão Razão de 0.33 = repressão 3-fold Razão de 10 = indução de 10-fold

13 Codificação de cor Dados apresentados em escala de cor Esquema: –Verde: reprimido (menos mRNA) –Vermelho = induzido (mais mRNA) –Preto = sem mudança (1:1 ratio) Ou –Verde - controle (e.g. aeróbico) –Vermelho = experimento (e.g. anaeróbico) Somente usada razão

14 Complicação: Série em Tempo Medida a cada 2 horas por 10 horas (depleção de oxigênio) 31,000 razões da expressão de genes 6,200 diferentes gráficos com 5 pontos cada Alguns genes respondem de maneira igual a depleção de oxigênio?

15 Exemplo: mudança de ratios (razão) Name0 hours2 hours4 hours6 hours8 hours10 hours Gene C Gene D Gene E Gene F Gene G Gene H Gene I Gene J Gene K Gene L Gene M Gene N Campbell & Heyer, 2003

16 Exemplo: transformação em log Name0 hours2 hours4 hours6 hours8 hours10 hours Gene C Gene D Gene E Gene F Gene G Gene H Gene I02320 Gene J Gene K Gene L Gene M Gene N Campbell & Heyer, 2003

17 Examplo: Coeficiente de Pearson Gene CGene DGene EGene FGene GGene HGene IGene JGene KGene LGene MGene N Gene C Gene D Gene E Gene F Gene G Gene H Gene I Gene J Gene K Gene L Gene M Gene N Campbell & Heyer, 2003

18 Exemplo: reorganização de dados Campbell & Heyer, 2003 Name0 hours2 hours4 hours6 hours8 hours10 hours Gene M Gene N Gene H Gene K Gene J Gene E Gene C Gene L Gene G Gene D Gene I Gene F

19 Exemplo: Campbell & Heyer, 2003

20 Genoma inteiro do fungo Campbell & Heyer, 2003

21 Tecnologia do DNA Microarray

22 DNA Microarrays

23 O que é Microarray? Coleção de sondas de DNA marcadas em meio sólido de forma ordenada.

24 PAra que é utilizado? Análise de expressão Genotipagem de SNP Profile de cromatina Identificação de inserções Análise de metilação de DNA

25 Por que usar Microaaray para análise de expressão? Análises de expressão convencionais somente permite o estudo de um gene em um experimento Permite o estudo da expressão de milhares de genes em um único experimento Permite a análise da expressão global de genes o que não é possível em técnicas convencionais

26 Análise de Expressão Convencional Electrophoresis and Blotting Labeled probe – gene X RNA Control Cells Treated Cells RNA Hybridization

27 Análise de expressão usando Microarray Treated Cells RNA Control Cells Label with Cy3 Label with Cy5 Hybridize, wash, and scan Microarray containing 16 probes

28 Tipos de Microarrays Spotted Arrays –cDNA ou DNA genômico –Oligonucleotídeos Affymetrix

29 Homemade Desenhado Mais barato? Máximo de análises por experimento Susceptível a variabilidade Disponível comercialmente Definido anteriormente Mais caro????? Maximo de análises por experimento Menos variável Spotted Arrays Affymetrix Arrays

30 Produção de Spotted Arrays Sondas de DNA preparadas em placas de 384 Lâminas de vidro compradas comercialmente ou homemade mesmo Arrays são spoted com um robô comercial Replicatas Controles

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32 Print 384-well plate 1 x 3 glass slide Water bath Wash Sonicator Spotted Array Printing Sonicate Pick up

33 Print 384-well plate 1 x 3 glass slide Water bath Wash Sonicator Spotted Array Printing Sonicate Pick up

34 Preparação da amostra alvo, marcação, hibridização, scaning e aquisição de dados Isolamento de RNA –Total RNA –mRNA Transcrição reversa Marcação Hibridização e lavagem Scaning

35 Treated Cells Control Cells RNA Label with Cy3 Label with Cy5 Hybridize Isolate RNA Reverse transcription cDNA Microarray containing 16 probes Wash and Scan

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38 Bibliografia Hedge, P., et al. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques 29, (2000). Lipshutz, R.J., et al. High density synthetic oligonucleotide arrays. Nature Genetics Supplement 21, (1999). Pritchard, C.C., Project normal: Defining normal variance in mouse gene expression. PNAS 98, (2001).


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