Métodos em Microscopia

Apresentação em tema: "Métodos em Microscopia"— Transcrição da apresentação:

1 Métodos em Microscopia
Instituto Brasileiro de Medicina de Reabilitação Disciplina: Biologia Celular e Molecular Métodos em Microscopia Reações citoquímicas e imunohistoquímicas

2 Citologia: Métodos em Microscopia
- Microscopia de luz - Microscopia de contraste de fase - Microscopia Confocal - Microscopia de fluorescência

3 Citologia: Métodos em Microscopia
Microscopia Óptica (Campo claro) Oculares Objetivas Condensadora Macro /Micro Filtros Charriot

4 Células e tecidos → tratamento químico que garanta sua preservação
Citologia: Métodos em Microscopia # Preparo de amostras Células e tecidos → tratamento químico que garanta sua preservação 1. Fixação 2. Desidratação 3. Emblocamento 4. Microtomia 5. Coloração

5 Citologia: Métodos em Microscopia
# Coloração Hematoxilina-Eosina Hematoxilina: cora azul estruturas ácidas (núcleo) Eosina: cora rosa estruturas básicas (citoplasma)

6 Citologia: Métodos em Microscopia
Espécimes transparentes???? Microscopia de Contraste de fase - Sistema de lentes - Luz muda de velocidade em estruturas com índice de refração diferentes - Estruturas mais claras e escuras - Células vivas

7 Microscopia de Contraste de fase

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9 Imagens NÃO são compostas de 1 plano Superposições em foco simultâneo
Citologia: Métodos em Microscopia Imagens NÃO são compostas de 1 plano Superposições em foco simultâneo Microscopia confocal - Plano focalizado de cada vez - Reconstrução tridimensional

10 Vasos sanguíneos da retina a partir do disco óptico

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12 Glicogênio em neurônios

13 Citologia: Métodos em Microscopia
Microscopia Fluorescência Anticorpos → ligação específica ao antígeno Localizar moléculas-alvo Direta: Anticorpo fluorescente (fluorocromo) Indireta: Adicionar um fluorocromo Microscópio de fluorescência Filtros seletivos → apenas a luz do corante usado é detectada

14 Citologia: Métodos em Microscopia
# Imunocitoquímica Direta Reação antígeno-anticorpo auxiliando a localização de estrutura celulares Marcação direta

15 Coelho Marcação Direta Anticorpos + Ligante Antígeno

16 Imunocitoquímica:(anticorpo secundário)
Marcação indireta Imunocitoquímica:(anticorpo secundário)

17 Flurocromo verde (1 canal)
Vermelho e amarelo (2 canais)

18 Glomérulo: Anti-IgM C. botulinum T. cruzi

19 CÉLULA E SUAS ORGANELAS
Instituto Brasileiro de Medicina de Reabilitação Disciplina: Biologia Celular e Molecular CÉLULA E SUAS ORGANELAS

20 CÉLULAS Unidades estruturais e funcionais dos organismos vivos
Forma, tamanho e funções  Características estruturais = Células são as unidade estruturais e funcionais de todos os organismos vivos. Podem variar no tamanho, na forma e na função especializada. Apesar das diferenças, células de todas as espécies compartilham certas características estruturais. 20

21 Charles Darwin - On the Origin of Species (1859)
“... De um começo tão simples, formas infindáveis, as mais belas e as mais maravilhosas, evoluíram e estão evoluindo.” Charles Darwin - On the Origin of Species (1859) EUCARIONTES: Ambientes extremos Patogênicas PROCARIONTES: Seres vivos são diferentes macroscópicamente Semelhanças: bioquímica, informação genética, produção de energia, síntese e degradação de blocos constituintes/biomoléculas (as vias metabólicas) As primeiras células surgiram há 3,5 bilhões de anos atrás em um ambiente rico em compostos orgânicos (anaeróbicas). Após o surgimento das células fotossintetizantes (produção de O2) surgiram organismos aeróbicos. Células eucarióticas surgiram 1,5 bilhões de anos (aumentaram de tamanho, compactação DNA, desenvolvimento de membranas). Archaea (arqueobactérias) são procariontes geralmente quimiotróficos, sobrevivem em lugares extremos (quentes, salino, pântanos, ambientes ricos em gás sulfídrico). Evoluíram a partir de uma bactéria e adquiriram algumas características dos eucariontes. 1º células surgiram há 3,5 bilhões de anos

22 PRINCIPAL DIFERENÇA ENTRE PROCARIONTE E EUCARIONTE?
Células procarióticas (pro “antes”; karyon “núcleo”)  ausência de núcleo definido e organização interna simples. Procariotos são representados por bactérias (eubactérias) e archaea (arqueobactérias) Células eucarióticas (eu “verdadeiro)  núcleo definido limitado por membrana e estrutura interna complexa Membrana nuclear e organelas limitadas por membrana

23 Citoesqueleto e membranas
COMO OS CONSTITUINTES CELULARES SÃO ORGANIZADOS NAS CÉLULAS? Procariontes Eucariontes Mesmo os organismos procariontes apresentam uma certa organização que é feita pelo citoesqueleto e membranas, apesar de não possuírem núcleo e nem membranas envolvendo as organelas. Procariontes - parede celular que contribui para organização celular da bactéria Citoesqueleto e membranas

24 CITOESQUELETO Estabiliza a forma celular, organiza o citoplasma e produz movimento CITOESQUELETO: formam uma rede tridimensional interligada em todo o citoplasma. É composto de subunidade protéicas simples que polimerizam para formar filamentos que sofrem montagens e desmontagem. Procariontes Eucariontes

25 CITOESQUELETO EUCARIONTES
Diferem em: largura, composição e função Microfilamentos - contração muscular Actina (todas as células) e miosina Filamentos intermediários Vimentina (mesênquima), desmina (músculo liso), queratina (epitélio) Microtúbulos Tubulina (fuso mitótico) Três tipos gerais de citoesqueleto diferem em largura, composição e função específica. Todos fornecem estrutura e organização ao citoplasma e à forma da célula. São todos componentes de matriz extracelular. Actina e Tubulina ajudam a produzir a movimentação de organelas ou de toda a célula. Ex: Filamentos de actina ligam-se a membrana plasmática e confere forma e rigidez à superfície celular. Ligam-se a miosina (converte energia do ATP movendo o filamento de actina). Complexo actina-miosina formam um anel contrátil que divide o citoplasma em 2 durante a citocinese. Ex: Vimetina reveste vasos sanguíneos. Ex: Tubulina permite a separação dos cromossomos (fuso mitótico). Movimento de bater dos cílios e flagelos envolve microtubulos.

26 QUEM DELIMITA O QUE É INTRA OU
EXTRA CELULAR? Superfície externa da célula está em contato com outras células, com o matriz extracelular, nutrientes, hormônios, fatores de crescimento e antígenos. Cultura de fibroblasto - em cinza é a matriz extracelular, composto por fatores de crescimento, hormônios importantes para interação célula-célula Células são os tijolos de uma casa em construção e o cimento é a matriz extracelular.

27 MEMBRANA PLASMÁTICA DELIMITA O QUE É INTRA OU EXTRA CELULAR

28 MEMBRANA PLASMÁTICA Componentes: Bicamada lipídica (colesterol, fosfolipídios) e proteínas imersas Funções: Limita o que é intra e extracelular Proteínas tem função de troca entre meio interno e externo (ex: canais, receptores) Troca pode ser com gasto de energia (transporte ativo) ou não (difusão simples) ou com auxílio de outras proteínas (difusão facilitada)

29 MEMBRANA PLASMÁTICA GLICOCÁLICE
Regula o que entra e sai da célula (seletiva) “Antenas moleculares” altamente específicas GLICOCÁLICE Sensores ambientais que fazem a célula saber como se comportar a determinado estímulo. Na membrana estão presentes transportadores que levam nutrientes e retiram produtos residuais da célula. Os receptores da membrana apresentam sítios de ligação específico. Quando um ligante externo se une ao receptor, a proteína traduz o sinal em uma mensagem intracelular. Ex: receptor associado ao canal iônico permite a entrada de íons específicos na célula. Antígenos (vírus, bactérias) ligam-se a receptores específicos e desencadeiam a produção de anticorpos. Endocitose e Exocitose

30 MEMBRANA PLASMÁTICA TRANSPORTES DE MEMBRANA

31 QUAL COMPONENTE PREENCHE O CITOPLASMA?
- Partículas e organelas - H2O, proteínas, sais minerais, aa, açúcares, precursores de ácidos nucléicos CITOSOL O citosol é o líquido que preenche o citoplasma, espaço entre a membrana plasmática e o núcleo das células vivas, que suporta bolsas, canais e organelas citoplasmáticas. É constituído por água, proteínas, sais minerais, iões diversos, aminoácidos livres e açúcares, enzimas, monômeros protéicos para produção de microtúbulos e filamentos de actina Conteúdo celular aquoso composto por partículas e organelas suspensas CITOSOL

32 COMPONENTES CELULARES?
RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO: rede tridimensional que auxilia o ribossomo na secreção de proteínas. RUGOSO - local onde ocorre a tradução da proteína (ribossomo) de lá é encaminhada para o complexo de golgi LISO - síntese de hormônios (adrenalina, noroadrenalina), absorção de fármacos nas células do fígado

33 RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
Rede intercomunicante de vesículas achatadas Membrana contínua

34 RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO RUGOSO
# Contínuo a membrana externa nuclear # Ribossomos # Secreção de proteínas

35 RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO LISO
# Contínuo ao rugoso # Síntese hormonal # Fármacos # Glicose-6-fosfatase Hidrólise do glicogênio

36 COMPLEXO DE GOLGI Direcionamento das proteínas “Correio”
Proteínas são modificadas (adição na cadeia lateral dos aminoácidos de grupamentos sulfato, carboidratos e lipídios) COMPLEXO DE GOLGI (correio pque direciona a proteína para seu local de ação): empilhamento de vesículas achatadas com um lado voltado para o retículo endoplasmático rugoso e outro para a membrana plasmática. As proteínas recém-sintetizadas no ribossomo ligadas ao retículo endoplasmático rugoso são inseridas no complexo de Golgi onde são modificadas (adição na cadeia lateral dos aminoácidos de grupamentos sulfato, carboidratos e lipídios). Isto permite o endereçamento correto da proteína que é feito por uma vesícula de transporte.

37 COMPLEXO DE GOLGI

38 ESTRUTURAS RESPONSÁVEIS PELA DEGRADAÇÃO?

39 LISOSSOMOS Vesículas esféricas com grande número de grânulos
Enzimas hidrolíticas Digerir moléculas sólidas (grandes)

40 # Originados no complexo de Golgi
LISOSSOMOS # Originados no complexo de Golgi

41 LISOSSOMOS E A DIGESTÃO CELULAR
ENDOCITOSE Fagocitose - Partículas sólidas - Estruturas de grandes dimensões  Pinocitose - Líquidos extra-celulares

42 FAGOCITOSE

43 PINOCITOSE

44 Peróxido de hidrogênio
PEROXISSOMO # Reações oxidativas: radicais livres # Oxidam moléculas menores → retiram átomos de H Peróxido de hidrogênio PEROXISSOMO: reações oxidativas na degradação dos aminoácidos e gorduras produzem radicais livres e peróxido de hidrogênio (H2O2) podendo lesar a maquinaria celular. Para proteger a célula o peroxissomo engloba o H2O2 que é degradado pela catalase.

45 ORGANELA RESPONSÁVEL PELA PRODUÇÃO DE ENERGIA?
MITOCRÔNDRIA: são as principais produtoras de ATP (principal molécula transportadora de energia das células) fornecendo energia para o trabalho celular.

46 MITOCÔNDRIA # Membrana Externa - lisa
# Membrana interna - invaginada (cristas) # Matriz - solução aquosa com enzimas e substâncias envolvidas na produção de energia MITOCRÔNDRIA: são as principais produtoras de ATP (principal molécula transportadora de energia das células) fornecendo energia para o trabalho celular. Apresentam 2 membranas. A externa é lisa e envolve a organela. A interna apresenta invaginações (cristas). Dentro da membrana interna está a matriz (solução aquosa com enzimas e intermediários químicos envolvidos no metabolismo produtor de energia).

47 ATP Ácido Pirúvico MITOCÔNDRIA Produtoras de ATP → ???? GLICOSE
Citosol CICLO DE KREBS ATP Ácido oxalacético

48 CENTRÍOLO # Estruturas cilíndricas # Microtúbulos # Divisão celular
“Orientam" o deslocamento dos cromossomos

49 QUAL A FUNÇÃO DA MEMBRANA NUCLEAR?
Informação Genética NÚCLEO: é envolto por 2 membranas e pelo retículo endoplasmático rugoso. Associados aos poros da membrana estão estruturas protéicas que permitem a entrada de moléculas sintetizadas no citoplasma e requeridas para replicação, transcrição e reparo do DNA. Produção e degradação simultânea de proteínas; especialização celular; reconhecimento e degradação de compostos estranhos (sem degradar compostos próprios da célula - Ex: degradação vírus sem degradar o DNA da própria célula).

50 NÚCLEO PRESENTE APENAS EM EUCARIONTES

51 DNA corpo poderia ser esticado até o Sol e voltar ~ 50 vezes
NÚCLEO Terra Distância 1,5 x 1011 DNA corpo poderia ser esticado até o Sol e voltar ~ 50 vezes NUCLÉOLO: DNA contem muitas cópias dos genes que codificam o RNA ribossomal. CENTRÍOLOS: compostos de proteína tubulina que permite a migração dos cromossomos durante a divisão celular.

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