Profa. Gláucia Maria Pastore

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1 Profa. Gláucia Maria Pastore
Proteases TA Profa. Gláucia Maria Pastore Laboratório de Bioaromas e Profa. Gabriela Macedo Laboratório de Bioquímica de Alimentos 10 de Novembro de 2005

2 Proteases: Definição Definição: Proteases catalisam a quebra das ligações peptídicas em proteínas. E.C: Classe 3 das hidrolases, e subclasse 3.4, das peptídeo-hidrolases ou peptidases.

3 Classificação das proteases:
FONTE: vegetais, animais ou microbianas Presentes no alimento Excretadas por microrganismos presentes nos alimentos Adicionadas como coadjuvantes de processo AÇÃO DO SÍTIO CATALÍTICO: Endopeptidases ou Exopeptidases Proteólise Limitada ou Ilimitada NATUREZA DO SÍTIO CATALÍTICO: Serina Cisteína Metaloproteases Aspartico proteases

4 Classificação das proteases (Hartley)

5 Proteases: Tipos catálise
1) Proteólise limitada: a protease cliva somente uma ou um número limitado de ligações peptídicas: uma proteína alvo para ativação como a conversão de prohormônios em hormônios. 2) Proteólise Ilimitada: quando as proteínas são degradadas em amino ácidos e seus constituintes

6 Aplicações Tradicionais de proteases vegetais e animais

7 Outras aplicações das Proteases
Detergentes Couros: substituição produtos do processo que são poluentes Produtos farmacêuticos: pomadas cicatrizantes, auxiliares digestivos Alimentos: amaciamento de carnes Reação de plasteína Solubilização de proteínas

8 Proteases Sulfidrílicas
ATIVIDADE DEPENDE DE UM OU MAIS GRUPOS SULFIDRILAS -SH NO SÍTIO ATIVO Ativadas por agentes redutores: cisteína Inativadas por oxidantes, íons metálicos PROTEASES VEGETAIS: bromelina, ficina e papaina PROTEASES MICROBINAS ALGUMAS Papaia: Látex do mamão papaya (Carica papaya) frações : papaína e chimopapaina Bromelina: Extração do caule da planta Ficina: Látex de figos verdes, maduro tem 125 menos atividade.

9 Mecanismo cisteína-protease

10 Inativação das proteases sulfidrílicas
SH : oxidado, enzima inativa Atividade inativada por agentes oxidantes tais como Oxigênio. Atividade pode ser recuperada por agentes redutores: cisteína.

11 Proteases vegetais: Cisteína Proteases
Esta família inclui as proteases vegetais tais como papaína, bromelina, ficina e também as catepsinas lisossomais de mamíferos e microbianas. São enzimas sulfidrílicas e apresentam SH no sítio ativo. Papaína é a mais estudada possui Cys 25 e His 159 no sítio ativo e a reação ocorre como nas serinas: em duas etapas. pH neutro, dependente do substrato.

12 Características proteases vegetais

13 Síntese de Plasteínas Plasteínas são polipeptídeos obtidos por síntese
utilizando-se a capacidade da papaína de polimerizar amac. Hidrolisado de soja def.metionina + ésteres de metionina Papaína Plastéina metionina incorporada ao hidrolisado

14 Proteases na clarificação de cervejas
Turvação da cerveja a baixa temperatura pode ter 2 causa basicamente: 1. Contaminação microbiana 2. Complexação de polipeptídeos e taninos quando a cerveja é resfriada. Taninos são compostos fenólicos presentes no lúpulo que contribuem para o sabor amargo e adstringência do produto. A utilização de papaína a fim de diminuir as cadeias de proteínas presentes e evitar a complexação com taninos é prática comum em algumas cervejarias.

15 Produção de queijo azul: blue cheese
Renina animal e microbiana Christian Hansen Economicamente mais importante na indústria de alimentos O papel do Penicillium roqueforti na produção do blue cheese está associado com a proteólise durante a maturação do queijo. Penicillium roqueforti: Endopeptidase e Exopeptidase Apesar da proteólise extensiva no blue cheese (baseada na grande quantidade de nitrogênio solubilizado) a textura e coesão ainda é retida.

16 Adição de enzimas para acelerar a maturação de queijos

17 Constituintes do leite:
K- caseina Propriedade especial: é única fração da caseína do leite solúvel na presença de íons Cálcio. Efeito estabilizante: estabiliza as frações da caseína em solução, pela formação de micélios coloidais.

18 Hidrólise da kapa caseína
O micélio coloidal formado pela kapa caseínatem PM e 100 nm. Partes hidrofílicas para fora do micélio. Partes hidrofóbicas: alfa s1 e s2 caseina para dentro. A kapa caseína é mais facilmente hidrolisada pois está na superfície da micela. A hidrólise da kapa caseína desestabiliza o micéliocausando a coagulação do leite. A hidrólise específica entre fenilalanina-metionina da k caseina pela renina, libera um peptídeo com carga altamente negativa,que se coagula na presença do Calcio. Renina K caseína p-k caseína + glicolipídeo Cálcio Coagulação

19 Renina (quimosina ou coalho animal)
Fonte: Abomasso (4O estômago do bezerro, cordeiro, cabrito)

20 Obtenção da renina Coalho

21 Pepsina Pepsina-protease ácida é extraída de estômago de suínos.
Aplicações: Nas preparações de renina como contaminante ou substituto de renina; Auxiliar da digestão Preparações de cereais e alimentos infantis Propriedades: pH ótimo: 1,0 - 4,0 pH estabilidade máxima: 5,0 - 5,5 Especificidade: relativamente ampla hidrolisando principalmente ligações peptídicas entre amac aromáticos.

22 ATIVIDADE DEPENDE DO GRUPO ÍON METÁLICO
Metaloproteases ATIVIDADE DEPENDE DO GRUPO ÍON METÁLICO SÍTIO ATIVO: Mg; Zn; Co, Fe, Hg, Cad, Cu, Ni O metal pode estar fortemente ligado e dificilmente ser removido ou estar fracamente ligado e ser removido por diálise contra EDTA. A remoção do íon inativa a enzima. São classificadas em exo e endo peptidases

23 Proteases: Endo e Exo peptidases
Endopeptidases : atuam nas regiões internas da cadeia polipeptídica, entre as regiões N e C terminal. Exopeptidases: Atuam somente nos finais das cadeias polipeptídicas na região N ou C terminal. Aquelas que atuam na região amino terminal livre liberam um único resíduo de aminoácido Aminopeptidases. As exopeptidases que atuam na região carboxi terminal livre liberam um único aminoácido Carboxipeptidases.

24 Carboxipeptidase A AmAc amargos
Remove aa do terminal carboxilia e favorece a liberação de aa com cadeias laterais aromáticas: Leucina Isoleucina Não hidrolisa substratos aa terminal: Arginina Lisina Prolina, É adequada para remoção do sabor amargo em hidrolisados proteicos: O sabor amargo é devido ao aparecimento de peptídeos que apresentam aa hidrofóbicos no terminal carboxílico: Leucina Prolina Valina Fenilalanina AmAc amargos

25 Peptídeos com cadeias laterais hidrofóbicas:
SABOR AMARGO Carboxipeptidases A - exopeptidase ou Aminopeptidase Sabor amargo desaparece

26 Serinas proteases Serina no sítio ativo
Tripsina, Quimitripsina, Elastase, Subtilisina Endoproteases Alcalinas pH 7,0 - 11,0 Inibidas por DFP (diisopropil fluorofosfato)

27 Tripsina Tripsina é extraída do pâncreas de suínos e bovinos. Serina protease. Produção de hidrolisado protéico: Aplicação. pH ótimo: 7- 9 Temperatura ótima: 50oC Especificidade: Mais específica para as ligações peptídicas envolvendo grupos carboxilas dos aa básicos: Lisina e Arginina. Tripsina é muito estudada é muito estudada devido às suas propriedades de ativação de outras proteases. E também porque alguns alimentos possuem inibidores desta enzima.

28 Tripsina Tripsinogênio Inativo Tripsina Tripsina Quimotripsinogenio
Quimotripsina ativa Carboxipeptidase Procarbosipeptidase A inativa

29 Proteases em panificação
As propriedades reológicas da massa de farinha de trigo são devidas às proteínas do Glúten. Glúten: responsável pela força da farinha e viscoelasticidade. A força está ligada à capacidade de reter gás durante a fermentação do pão. Rede de gluten. Agentes oxidantes: Bromato Peróxido melhoram a farinha Iodato Redutores: pioram a farinha: cisteína e glutation

30 Proteases em panificação:
Proteases fúngicas de Asp. Oryzae são misturas de exo e endo peptidases. Rompem a rede do Glúten por hidrólise das ligações peptídicas diminuindo elasticidade e viscosidade da massa. Reduzem o tempo de mistura. Vantagens: elasticidade e textura melhores retenção de gás maior Melhor simetria Aroma tempo de estocagem maior.

31 Agradecemos à todos pela Atenção ...
Proteases TA Profa. Gláucia Maria Pastore Laboratório de Bioaromas e Profa. Gabriela Macedo Laboratório de Bioquímica de Alimentos 10 de Novembro de 2005 Agradecemos à todos pela Atenção ...