Primer Design.

Apresentação em tema: "Primer Design."— Transcrição da apresentação:

1 Primer Design

2 A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA.
O molde é um DNA dupla fita. Um par de primers é adicionado, cada um com a sequencia coincidente com o final de uma das extremidades a serem amplificadas. A Taq termoestavel e os dNTPs são adicionados a reação. No primeiro ciclo, o aquecimento a 95°C abre a dupla fita de DNA e o subsequencte resfriamento a 60°C permite que os primers hibridizem com a sequencia complementar no DNA alvo. A polimerase extende cada primer a partir da porção 3’ pela polimeração dos dNTPs, gerando novas fitas sintetizadas.

3 A reação de PCR produz uma quantidade de DNA que dobra a cada ciclo de sintese.
Modified from: Molecular Biology of the Cell, 3rd edn by Bruce Alberts, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and James D. Watson.

4 Regras gerais para o desenho dos primers
This table is modified from that of A. Sharrocks (1994) in “PCR Technology. Current Innovations” (eds. H.G. Griffin and A. M. Griffin) CRC Press, Boca Raton.

5 Sequencia única de nucleotídeos do molde de DNA
Importante para especificidade de amplificação G G A T C CAATTTTGTCGATCCCGATC …GTATCGTTAAAACAGCTAGGGCTAGGAC…

6 Grampo de G/C na porção 3' A porção 3‘ do primer deve ser G ou C para aumentar o correto anelamento do primer G-C possui pontes de hidrogenio mais fortes que A-T Lembre-se que a porção 3’ frequentemente determina o anelamento. Se voce tem um primer em que pelo menos 5-10 nt complementam exatamente com a porção 3’, o anelamento provavelmente funcionará.

7 Sem auto-complementaridade
O auto-pareamento diminui a habilidade do primer se anelar com o molde. Como regra geral, não use primers com mais de 3 bases no inicio que se complementam com as bases da porção 3’.

8 Não dimerização Os pares de primers podem alinhar entre si. Se este
alinhamento inclui pelo menos uma das porções 3’ a polimeras irá extender apenas a porção entre os dois resultando na formação de um dímero: 5’ GTTCAAATGGCATCGTAGGGATGCAT 3‘ | | | | | | | 3’ ACCGTAGTACTGCCG 5’

9 Distribuição randomica de bases e composição
Se o conteúdo de G+C% dos dois primers for muito diferente eles terão diferentes Tms e não anelarão a mesma temperatura. Se todos os nucleotídeos da porção 5’ do primer forem G ou C e todos os da porção 3’ forem A ou T, mesmo que a proporção esteja correta, a porção 3’ não se anelará na temperatura predita.

10 Tamanho do primer O tamanho do primer deve ser longo o bastante para garantir que uma única sequencia seja amplificada e não tão longo para afetar a Tm e o anelamento. Os melhores tamanhos variam de 14 a 30 nucleotídeos.

11 Equivalencia de Tm A Tm aproximada pode ser calculada pela fórmula:
Tm = 4(G + C) + 2(A + T)oC. A temperatura de alinhamento depende diretamente do tamanho e da composição dos primers. Um primeira tentativa pode ser feita com a reação a 5°C abaixo da Tm estimada para os primers A principal consequencia de se utilizar uma Tm muito baixa é a possibilidade do primer anela com qualquer sequencia do DNA , perdendo a especificidade

12 Tamanho do amplificado
O máximo rendimento é obtido em uma reaçao de PCR quando o tamanho do produto é entre nt. Diferentes polimerases possuem diferentes graus de processividade e diferentes tamanhos ótimos.

13 Ferramentas para desenho:
Primer 3 GeneRunner NCBI

14 Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm
Escolhe normalmente os 3 melhores pares de primers para a seqüência proposta É bastante exigente.

15 GeneRunner Excelente para conferir os oligos obtidos com o Primer3
Pouco exigente quanto aos seus próprios critérios

16 NCBI Importante para conferir se a seqüência escolhida não amplifica nenhum outro gene do organismo escolhido ou o mesmo gene em possíveis contaminantes.