SILVYA STUCHI MARIA-ENGLER CLINICAL CHEMISTRY AND TOXICOLOGY DEPT

Apresentação em tema: "SILVYA STUCHI MARIA-ENGLER CLINICAL CHEMISTRY AND TOXICOLOGY DEPT"— Transcrição da apresentação:

1 SILVYA STUCHI MARIA-ENGLER CLINICAL CHEMISTRY AND TOXICOLOGY DEPT
XIV SIMPÓSIO DE BIOSSEGURANÇA E DESCARTES DE PRODUTOS QUÍMICOS PERIGOSOS E ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIDFICADOS (OGMs) EM INSTITUIÇÕES DE ENSINO E PESQUISA I SIMPÓSIO DE SEGURANÇA QUÍMICA E BIOLÓGICA MÉTODOS ALTERNATIVOS À EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL NO COTEXTO DE BIOSEGURANÇA SILVYA STUCHI MARIA-ENGLER CLINICAL CHEMISTRY AND TOXICOLOGY DEPT SCHOOL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES UNIVERSITY OF SÃO PAULO three-dimensional (3D) cell culture systems have gained increasing interest in drug discovery and tissue engineering due to their evident advantages in providing more physiologically relevant information and more predictive data for in vivo tests. The innovations and development in 3D culture systems for drug discovery over the past 5 years are also reviewed in the article, emphasizing the cellular response to different classes of anticancer drugs, focusing particularly on similarities and differences between 3D and 2D models across the field. The progression and advancement in the application of 3D cell cultures in cell-based biosensors is another focal point of this review. GOOD MORINING, I AM GOING TO HAVE YOU A SNAP SHOT OF ACTIVITIES OF our lab,, located at School of Pharmaceutical Sciences. I am interested in melanocyte transformation and melanoma invasion and Dr Berlanga, who is present here (good morning, Dr Berlanga) is personally envolved with phototoxicity and photoprevention. So, we understood that to set up a model of skin reconstruction at the lab would help to widely investigate skin disorders. So, as a alternatative method for.... We are from Pharmacy School, Clinical Chemistry and Toxicology Department. Patology and Clinical Cytology Lab coordenated by Silvya Stuchi Maria-Engler and Silvia Berlanga de Moraes Barros Our lab is interested in alternative methods in order to test new molecules which can be product of chemical synthesis either extracts or isolated molecules from Brazilian Flora. Is becoming a lab focused on skin and we are intereseted in eficacy, photoprotection, anti-melanoma. 1

2 PHARMACEUTICAL SUPPLY CHAIN:
BIOSAFETY MATTERS!!!! Cell culture is a important step of pharmceutical suplly chain and can be longer than those 4 years and is estimated that thousands to one so, works as a Large-molecule therapeutics, which cannot be produced by chemical synthesis, are traditionally manufactured either through microbial fermentation or more commonly via mammalian cell culture.

3 Why do companies test cosmetics, pharmaceuticals and other products on animals?
Determination of quantitative or qualitative value of risk related to a concrete situation and a recognized threat (also called hazard). Why do companies test cosmetics or other products on animals? Because is need to determine quantitative or qualitative value of risk related to a concrete situation and a recognized threat and animal testing It is clear that animal testing animal research and testing has played….. for the time has come for alternative method and it started decades ago since bur REACH is the Regulation on Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals. It entered into force on 1st June It streamlines and improves the former legislative framework on chemicals of the European Union (EU). The main aims of REACH are to ensure a high level of protection of human health and the environment from the risks that can be posed by chemicals, the promotion of alternative test methods, the free circulation of substances on the internal market and enhancing competitiveness and innovation. REACH makes industry responsible for assessing and managing the risks posed by chemicals and providing appropriate safety information to their users. In parallel, the European Union can take additional measures on highly dangerous substances, where there is a need for complementing action at EU level.

4 Why do companies test cosmetics, pharmaceuticals and other products on animals?
Determination of quantitative or qualitative value of risk related to a concrete situation and a recognized threat (also called hazard). 80 90 2000 - Adopting of 3 Rs - Reduction, Refinement, Replacement (Russell & Burch, 1959). ECVAM promotion and validation of in vitro assays Seventh Amendment to the Cosmetics. imposes a ban on marketing cosmetics in Europe if the finished product or its ingredients have been tested using animals. REACH - EUROPEAN REGULATION, 2006 Regulation on Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals. Why do companies test cosmetics or other products on animals? Because is need to determine quantitative or qualitative value of risk related to a concrete situation and a recognized threat and animal testing It is clear that animal testing animal research and testing has played….. for the time has come for alternative method and it started decades ago since bur REACH is the Regulation on Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals. It entered into force on 1st June It streamlines and improves the former legislative framework on chemicals of the European Union (EU). The main aims of REACH are to ensure a high level of protection of human health and the environment from the risks that can be posed by chemicals, the promotion of alternative test methods, the free circulation of substances on the internal market and enhancing competitiveness and innovation. REACH makes industry responsible for assessing and managing the risks posed by chemicals and providing appropriate safety information to their users. In parallel, the European Union can take additional measures on highly dangerous substances, where there is a need for complementing action at EU level. Animal testing for research and development Animal research and testing has played a part in almost every medical breakthrough of the last century. It has saved hundreds of millions of lives worldwide...”

5 Alternative Methods Brazil
2012 2013 March Publication of Law AROUCA /08 Creation of the National Council for the Control of Animal Experimentation - CONCEA CONCEA: After the validation of the alternative methods in Brazil, companies will have up to five years to implement them Creation of BraCVAM connected to the National Institute of Quality Control and Health - INCQS FIOCRUZ Creation of RENAMA - National Network of Alternative Methods (MSTI) Law : Ban the use of animals in cosmetics testing. Government of São Paulo Em 1934 o governo brasileiro criou um decreto que estabelecia medidas de proteção aos animais. E em 1979 foi promulgada a primeir lei que estabeleceu normas para a pratica didatica cientifica da vissecção de animais. 1988 Regulamentação da proteção à fauna e flora (reforçadas por lei promulgada em 1998, que proibia os mals tratos aos animais) Lei arouca regulamentação da experimentação animal em estabelecimentos de ensino e pesquisa. CONCEA : monitoramento ao comprimento das normas para utilização humanitária dos animais em ensino e pesquisa. BraCVAM identifique, nacional e internacionalmente, métodos alternativos, sugerindo a adaptação à demanda nacional e estimulando a substituição dos métodos em estudos brasileiros. Além disso, o centro também seria responsável por receber propostas de universidades, instituições de pesquisas e indústrias que tenham criado novos métodos e queriam submetê-los a aprovação no Brasil. A Renama, constituída por laboratórios públicos, privados, universidades e indústrias, executaria efetivamente esses estudos, verificando a eficácia, e o Consea avaliaria o método e os resultados, propondo sua oficialização.

6 RUSSELL, W. M. S. AND BURCH, R. L
RUSSELL, W.M.S. AND BURCH, R.L. The Principles of Humane Experimental Technique Methuen, London, 1959 Redução: obter informações comparáveis de um número menor de animais. Substituição: uso de métodos não animais sempre que for possível alcançar os mesmos objetivos científicos. Refinamento: minimizar ou aliviar a dor potencial, sofrimento ou angústia e melhorar o bem- estar animal. Refinamento O Termo refinamento significa a modificação de algum procedimento operacional com animais, objetivando minimizar a diminuição da dor e o estresse. A experiência da dor e do estresse tem, como resultado, mudanças psicológicas que aumentam a variabilidade experimental dos resultados. O interesse dos cientistas é assegurar que as condições ambientais para os animais sejam as melhores possíveis. Os testes considerados menos invasivos podem ser utilizados para diminuir a angústia causada durante o estudo. Além disto, é importante que toda a equipe envolvida seja bem treinada e competente no que se refere a correta atitude em relação aos animais. Redução A concepção de redução como alternativa estratégica, resulta em menor número de animais sendo utilizados para obter a mesma informação, ou maximização da informação obtida por animal. Existem várias possibilidades para redução do uso de animais. Alguns laboratórios alertam todos os pesquisadores quando as pesquisas levam o animal a morte. Assim, é dado preferência para pesquisas que utilizem os vários órgãos de um mesmo animal, associadas aos dados apropriados e princípios estatísticos.  Em outros casos, pode-se executar um estudo piloto indicando se o procedimento será apropriado para um estudo maior. Para tanto é possível a utilização de estudos preliminares in vitro, os quais podem indicar novos caminhos, utilizando técnicas não invasivas. Substituição Um sistema experimental que esteja vinculado à totalidade da condição de vida animal, pode ser considerado como substituto alternativo. Pode-se citar a proposta de obtenção de células, tecidos ou organismos para subseqüentes estudos in vitro ao invés da matança de animais. Portanto, verifica-se que alguns métodos alternativos, podem ser utilizados na total substituição em estudos animais e outros, podem complementar dados, auxiliando na redução de utilização de animais empregados em todo projeto. O maior ímpeto de desenvolvimento para testes alternativos tem sido determinado pela indústria farmacêutica. Este investimento tem conduzido para o desenvolvimento adequado da triagem dos componentes para avaliação de potencial toxicológico e eficácia. A utilização da informática, as informações sobre matérias-primas, técnicas físico-químicas, cultura de células, tecidos e órgãos, contribuem para um banco de informações, evitando a duplicação desnecessária de trabalho com animais.

7 Critérios normativos mínimos para as pesquisas que utilizam animais
Definir objetivos legítimos para a pesquisa em animais; Impor limites à dor e ao sofrimento; Garantir tratamento humanitário; Avaliar previamente os projetos por um Comitê Independente; Fiscalizar instalações e procedimentos; Garantir a responsabilização pública Hampson J. Animal Experimentation: practical dilemmas and solutions. In: Paterson D, Palmer M. The status of animals. Oxon (UK): CAB, 1989: 101.

8 TESTE DE DRAIZE Este teste é um dos mais criticados, particularmente no que diz respeito à avaliação do potencial de irritação ocular de produtos cosméticos. Avaliar os efeitos da irritação de substâncias na conjuntiva, na córnea e na íris de olhos de coelhos albinos. Kay & Calandra (1962) incluíram parâmetros como eritema e espessura das pálpebras, abrangendo edema, lacrimejamento, opacidade, danos e neovascularização da córnea neste protocolo.

9 TESTE DE DRAIZE Estimativas variáveis de irritação ocular
% variabilidade intra laboratorial - Variabilidade da exposição tempo e dose - Variações das respostas entre animais Diferenças entre coelhos e humanos - Diferenças fisiológicas - Coelhos mais sensíveis que humanos

10 TESTE DE OPACIDADE DA CÓRNEA BOVINA (BCOP)
São testadas : opacidade e permeablidade de córnea provinda de olhos de bovinos (que seriam descartados), após a exposição à substância a ser testada.

11 MICROORGANISMOS Geralmente os microorganismos, tais como bactérias e leveduras, são aceitos como modelos para estudo de metabolismo, genética e bioquímica.  Exemplo - Leveduras: Possuem receptores de estrogênio que apresentam afinidade idêntica aos encontrados em útero de ratas. Cienc. Cult. vol.60 no.2 São Paulo  2008

12 TESTE DA MEMBRANA CORION ALANTÓIDE (HETCAM):
Utiliza ovos de galinha fertilizados Avalia a irritabilidade da membrana corion alantóide, que possui uma grande quantidade de vasos sanguíneos Semi-quantitativo (hiperemia, hemorragia e coagulação), após cinco minutos de aplicação do produto, puro ou diluído, sobre a membrana cório-alantóide.

13 MODELOS MATEMÁTICOS Os modelos matemáticos podem contribuir para o trabalho experimental através da definição de variáveis e testando teorias, reduzindo o custo desses experimentos e os tornando mais eficazes. Um exemplo disso é a predição, através de modelos matemáticos, da estrutura de proteínas, que poderiam prever suas propriedades físicas e químicas. É sempre preciso lembrar que computadores processam e armazenam conhecimentos já existentes e muitos deles foram adquiridos com a utilização de animais na pesquisa. Cienc. Cult. vol.60 no.2 São Paulo  2008

14 SISTEMAS IN VITRO Experimentos in vitro são apropriados para algumas áreas da ciência biológica. Por exemplo, vários estudos sobre o metabolismo intermediário utilizam a bioquímica para o estudar a dinâmica de reações enzimáticas que ocorrem em nosso sistema biológico. Cienc. Cult. vol.60 no.2 São Paulo  2008

15 Aceitação de metodologias alternativas pela OECD
Refinamento: Teste indolor para a sensibilização da pele Redução: O número de animais para toxicologia aguda 45-8. Substituição: Fototoxicidade Irritação e corrosão ocular /cutâna

16 BRASIL EM RELAÇÃO AOS MÉTODOS ALTERNATIVOS
No Brasil, as primeiras medidas para o estabelecimento de métodos alternativos iniciaram após 2007 com a publicação da Lei AROUCA a qual regulamenta a experimentação animal em estabelecimentos de ensino e pesquisa que teve como desdobramento, a criação do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) que possui dentre suas responsabilidades monitorar e avaliar a introdução de técnicas alternativas que substituam o uso de animais no ensino e na experimentação. Em 2012, tivemos a criação do Centro Brasileiro de Validação de Métodos Alternativos (BraCVAM), o primeiro da América Latina a validar e coordenar estudos de substituição, redução ou refinamento do emprego de cobaias em testes de laboratório; Também houve a criação da RENAMA, a Rede Nacional de Métodos Alternativos, uma rede de laboratórios oficiais e universidades, da qual o nosso laboratório participa colaborando na padronização e estabelecimento de metodologias alternativas a experimentação animal. Em 2013, dois fatos colocaram a discussão sobre métodos alternativo em foco no Brasil, a invasão ao instituto Royal por ativistas e a criação de uma lei do governo de São Paulo que proibia estudos em animais para fins cosméticos. No entanto, o Brasil ainda não tem condições de aprovar e seguir leis como essas, isso motivou a manifestação do CONCEA para que houvesse esse esclarecimento. Neste ano, tivemos grandes avanços com o estabelecimento pelo CONCEA do prazo de cinco anos, 2019, para que os laboratórios passem a utilizar metodologias alternativas e o reconhecimento pela ANVISA juntamente com o CONCEA de 17 metodologias validadas na EU. Não conseguimos determinar quanto que o nosso país vem investido para isso. E 238MI PEDROSA et al. 2015

17 CONCEA & ANVISA SET/14 I - Para avaliação do potencial de irritação e corrosão da pele: Método OECD TG Corrosão dérmica in vitro: Teste de Resistência Elétrica Transcutânea; Método OECD TG Corrosão dérmica in vitro: Teste da Epiderme Humana Reconstituída; Método OECD TG Teste de Barreira de Membrana in vitro; e Método OECD TG Teste de irritação Cutânea in vitro. II - Para avaliação do potencial de irritação e corrosão ocular: Método OECD TG Teste de Permeabilidade e Opacidade de Córnea Bovina; Método OECD TG Teste de Olho Isolado de Galinha; Método OECD TG Teste de Permeação de Fluoresceína. III - Para avaliação do potencial de fototoxicidade: Método OECD TG Teste de Fototoxicidade in vitro 3T3 NRU. IV - Para avaliação da absorção cutânea: Método OECD TG Absorção Cutânea método in vitro. V - Para avaliação do potencial de sensibilização cutânea: Método OECD TG Sensibilização Cutânea: Ensaio do Linfonodo Local; e Método OECD TG 442A e 442B - Versões não radioativas do Ensaio do Linfonodo Local. VI - Para avaliação de toxicidade aguda: Método OECD TG Toxicidade Aguda Oral – Procedimento de Doses Fixas; Método OECD TG Toxicidade Aguda Oral – Classe Tóxica Aguda; Método OECD TG Toxicidade Aguda Oral – procedimento "Up and Down"; e Método OECD TG estimativa da dose inicial para teste de toxicidade aguda oral sistêmica. VII - Para avaliação de genotoxicidade: Método OECD TG Teste do Micronúcleo em Célula de Mamífero in vitro.

18 ALL MODELS HAVE LIMITATIONS
NO MODEL CAN POSSIBLY EXPLAIN EVERY DETAIL OF A SCIENTIFIC PHENOMENA drug properties, absorption, distribution, metabolism, elimination and toxicity, are properties crucial to the final clinical success of a drug candidate. It has been estimated that nearly 50% of drugs fail because of unacceptable efficacy, which includes poor bioavailability as a result of ineffective intestinal absorption and undesirable metabolic stability. It has also been estimated that up to 40% of drug candidates have failed in the past because of safety issues. Species differences between animals and humans can cause fundamental confounders such as metabolic processes, enzymes, and membrane proteins. in vitro human cell-based drug evaluations, including drug efficacy testing, toxicology, and basic cell biology, are of great importance as an alternative to animal experiments to solve the significant issue of species differences.

19 (3R) RECYCLING SKIN Foreskin Separation and digestion keratinocytes
ALTERNATIVE METHOD FOR SCREENING OF: NEW COMPOUNDS BASED ON BRAZILIAN FLORA PLANT EXTRATS NEW SYNTHETIC MOLECULES/ COMPOUNDS PHARMACOLOGICAL POTENTIAL AND CLINICAL APPLICATIONS IN SKIN ANTI-TUMORAL (melanoma, cervical cancer) SKIN DISORDERS (psoriasis) COSMETICS INDUSTRY ( BRAZIL AS A HUGE MARKET) Foreskin Separation and digestion We are implement the 3rs concept recyclcing skin. We receive foreskin and keratinocytes fibroblasts melanocytes

20 KERATINOCYTES AND MELANOCYTES
DERMIC EQUIVALENT + K e M KERATINOCYTES AND MELANOCYTES AIR LIQUID INTERFACE Collagen type I gel is mixed with human fibroblasts to generate derm equivalent , on the top of this keratinocytes and melanocytes are seeded, this structure is then air lift cultured. Following 9-11 of culture a skin structure very similar to that of human skin is eveident by mycroscopy. 2 WEEKS LATER SKIN RECONSTRUCTED Brohem et al... Maria-Engler., Pigment cell and Melanoma Research

21 FULL-THICKNESS SKIN MODEL AND MELANOMA INVASION IN FULL THICKNESS
Reconstructed Skin Keratinocytes Melanocytes Melanoma In Reconstructed Skin Melanoma Fibroblasts How do we generate this model? It is a sophistiated culture since e have a co-culture of 3 different cell types, as a fibroblast, melanocytes and keratinocytes cells in the same model. We also add a forth cell type, as melanoma, dependent on our research question. 21

22 ORGANOTYPIC CELL CULTURE MODELS PROVIDE ESSENTIAL CONTEXT-DEPENDENT INFORMATION CRITICAL FOR THE DEVELOPMENT OF NEW THERAPEUTIC STRATEGIES Figure 8- Inhibition of invasion of metastatic melanoma artificial skin after treatment for 72hrs with 4-NC. (A) HE; (B) Immunostaining for keratin 14. Control – No melanoma on the artificial skin. NT - artificial skin in the presence of melanoma cell line SK-Mel-103 and no treatment- artificial skin in the presence of melanoma cell line SK-Mel-103, and treated at concentrations of 10 and 30μM respectively. Arrows indicate melanoma spots. (A) 20x, (B) 40x magnification. K14- basalo and supra basal layers We used some differentiation markers to observe the reepithelization of the reconstructs. As we can see, CK 10 is a marker of suprabasal layers in normal skin, however it doesn´t mark the melanoma cells. The opposite is seen with CK14, S100 (a melanin marker) and Involucrin (component of FK crosslinked envelope) where we can follow melanoma invasion and its reduction with the 4NC presence a4-NC was not toxic for the fibroblasts, constituents of the dermal layer, and it allowed the reepithelization of the epidermal layer in the skin reconstruct. Cytokeratins 10 and 14, involucrin and type IV collagen were used as markers of epidermal differentiation. Fast Red and enhancer Naphtol. The counterstaining is with hematoxylin (blue) c

23 PELE ARTIFICIAL INFECTADA COM HPV16: CANCER CERVICAL IN VITRO
E6 E7 HPV16 ONCOPROTEINS IN ORGANOTYPICAL CULTURE: CERVICAL CANCER IN VITRO PELE ARTIFICIAL INFECTADA COM HPV16: CANCER CERVICAL IN VITRO pLXSN E6 wt E7wt E6E7 Organotypic culture of human papillomavirus. PHKs are either transfected with plasmids that recombine in vivo to give circularized HPV18, or the PHKs are infected with HPV18 virions produced from organotypic cultures of HPV18-transfected PHKs. The PHKs are placed on a collagen-fibroblast matrix, lifted (“rafted”) when confluent and grown for 10–14 d. E7 induces the subrabasal cells to remain in cycle and cellular DNA replication occurs; the HPV genome remains a low-copy episome. When cellular DNA synthesis is complete, there is a brief pseudo-S-like or G2-like phase, in which viral DNA replication occurs. The high levels of E2 repress E6/E7 transcription, turning off the markers of S phase, re-expressing p130, and allowing late gene transcription, capsid assembly, and the final stages of epithelial differentiation. Selective media have now been designed for epithelial and other cell types (see Chapter 4), and with some of these it has been shown that serum is inhibitory to growth and may promote differentiation (16). Primary culture of epithelial tissues, such as skin, lung, and mammary gland, is routine in some laboratories (19), and prepared cultures are available commercially (for example, Clonetics; Promocell). Laura Cardeal et al Silvya Maria-Engler, FCF-USP, PLoS One. 2012;7(3) 2012 Mar 16. 23

24 Peles Hiperpigmentadas 1 MP : 3 KP
Glicated Non= treated PIGMENTED SKIN RECONSTRUCTED PHOTOPROTECTION AND PHOTOAGING MODEL (UV EFFECT)

25 12 DAYS IN AIR-LIQUID INTERFACE 1 DAY IN MEDIUM
DERMAL EQUIVALENT: COLLAGEN+ FIBROBLASTS + K e M KERATINOCYTES AND MELANOCYTES DERMAL EQUIVALENT AIR LIQUID INTERFACE 2 WEEKS LATER SKIN RECONSTRUCTED Corneum Granulosum Spinous basal Collagen IV film KCs 12 DAYS IN AIR-LIQUID INTERFACE 1 DAY IN MEDIUM Collagen type I gel is mixed with human fibroblasts to generate derm equivalent , on the top of this keratinocytes and melanocytes are seeded, this structure is then air lift cultured. Following 9-11 of culture a skin structure very similar to that of human skin is eveident by mycroscopy. EPIDERMAL EQUIVALENTS

26 + DEVELOPMENT OF EPIDERMAL EQUIVALENT Immersion fase
Air-liquid interfase Deep Well

27 Artificial Skin In Pharmaceutical/Cosmetic productive chain in Brazil
Brazil is one of the largest consumer markets of cosmetic in the world. In Brazil, the use of artificial skins as alternative methods for cosmetics testing is still lacking; The importation of commercial kits of artificial skin is unfeasible due to customs processing issues; Systematize the protocol of generation of the epidermal equivalent on transwell focused on future evaluation of safety and efficacy tests; Investigate the functionality of the model evaluating corrosive and non-corrosive substances via MTT, according to the Guide OECD (“Organization for Economic Co-operation and Development)”; Foruns de competitividade MDIC 27 27

28 OECD Recommends epidermis models in house epidermal equivalente
RENAMA (BRAZILIAN NETWORK FOR ALTERNATIVE METHODS) MCTI/ CNPQ 2013 AIM: SKIN RECONSTRUCTS (EPIDERMAL LAYERS) RENAMA (BRAZILIAN NETWORK FOR ALTERNATIVE METHODS) MCTI/ CNPQ 2013 AIM: SKIN RECONSTRUCTS (EPIDERMAL LAYERS) AS A KIT RENAMA (BRAZILIAN NETWORK FOR ALTERNATIVE METHODS) MCTI/ CNPQ 2013 AIM: SKIN RECONSTRUCTS (EPIDERMAL LAYERS) AS A KIT Irritation and Corrosion assays EpiDerm TM Tissue Model (MatTek) SkinEthic TM RHE (L’oreal) EpiSkin model LabCyte EPI-MODEL in house epidermal equivalente

29 Brazilian Network on Alternative
RENAMA ACHIEVEMENTS: Brazilian Network on Alternative Methods Epidermal Equivalent in vitro Draize Test EpiDerm™ Tisue Model MatTek® Skin USP (2014) SkinEthic L´Oreal Human epidermis EpiSkin VMR= validated methods references corneum granulosum spinous basal Nossa equipe trabalhou no desenvolvimento do protocolo de epiderme human reconstiuída gerando um modelo compatível com aqueles reconhecidos ( VMR= validated methods references) e assim submetemos o modelo parcialmente aos testes de profici6encia dos guias 431 e 439 de corrosao e irritacao. Nós superamos as dificuldades e chegamos a termo com od esenvolvimento da epiderme humana reocnstituída The new OECD Test Guideline 431 “In Vitro Skin Corrosion” (OECD, 2004) defines the requirements for in vitro skin models to be validated for skin corrosivity testing. show a proper epidermal morphology with high comparability to the native situation. A minimum of 5 viable cell layers exhibit a progressing differentiation from the bottom towards the stratum corneum. These viable layers are forming the stratum basale, spinosum and granulosum. On top at least 10 layers of finally differentiated keratinocytes are forming the stratum corneum. The described architecture has been reproducibly observed in all sections of different production charges analysed so far. – Potencial de irritação e corrosão da pele 1) OECD TG 430 – corrosão dérmica in vitro: teste de resistência elétrica transcutânea 2) OECD TG 431 – corrosão dérmica in vitro: teste da epiderme humana reconstituída 3) OECD TG 435 – teste de barreira de membrana in vitro 4) OECD TG 439 – teste de irritação cutânea in vitro

30 Validation of an in house Epidermis Reconstructs (ER)
Standarizing the protocol: ER: Morphological analisys  HE staining and Protein expression  imunofluorescence HE Ki67 CK14 CK10 Involucrin Filagrin Importância de colágeno 1 CATARINO, C. M, et. al. Desenvolvimento de epiderme equivalente sobre membrana do tipo transwell e membrana biopolimérica,  tese mestrado, 2015

31 HE CK10 SkinEthic EpiSkin® Skin Corrosivity Assay (OECD 431):
EpiSkin® is a 3D cell-culture-based model of human epidermis, reconstructed from cells derived from donated human skin. In the corrosivity assay, test item is applied to the upper surface of the epidermis for two exposure periods (3 minutes and 1 hour) and then rinsed off. This assay can classify substances as corrosive or non-corrosive. SkinEthic EpiSkin® Skin Irritation Assay (OECD 439): In this irritation assay, test item is applied to the upper surface of the epidermis for 15 minutes, then rinsed off and cells are incubated for 42 hours to allow recovery or development of damage. This assay can classify substances as irritants in accordance with GHS Category 2.

32 MICROFLUIDIC SYSTEMS, ORGAN AND BODY ON A CHIP

33 AS ALTERNATIVE TO ANIMAL TESTING
IN VITRO METHODS 2D X 3D AS ALTERNATIVE TO ANIMAL TESTING Cell-based drug evaluations have generally been performed in a plastic dish under monolayer (two-dimensional; 2D) cell conditions. Since nearly all tissues are integrated three-dimensional (3D) structures of multiple types of cells and extracellular matrices (ECMs), and since intercellular signaling is important for biological functions, it is general- ly difficult to estimate the actual drug effects on physiologic functions by 2D-culture methods. The development of 3D human tissue constructs consisting of simplified tissue structures with multiple types of cells and ECMs is a key challenge for pharmaceutical and pathophysiological evaluations and tissue engineering. In general, a cell spheroid has been employed as the 3D-culture model, especially 3D-cancer spheroids for metastasis or pharmacologi- cal assays of cancer cells [4–6] and 3D-hepatocyte spheroids for induc- ing higher activity of hepatocytes [7–9]. Although, interesting 3D-co- culture spheroids have been reported to investigate tumor invasion [10,11], to enhance hepatocyte functions [12] and to mimic in vivo con- ditions [13], the reconstruction of the delicate and precise 3D-location of multiple types of cells has not been achieved yet due to their hetero- geneity, the lack of control of the cell number and location, and necrosis inside the cells because of insufficient nutrients.

34 SKIN BIOLOGY GROUP -FCF -USP
Collaborators: Silvia Berlanga M. Barros, USP Lorena R. G. Cordeiro, USP-RP Daniele Palma, USP-RP Luisa Villa, USP Enrique Boccardo, USP Luciana B. Lopes, USP Paulo Zaini, IQ-USP Márcia Consolaro, UEM, PR Carmen Ferreira, UNICAMP K. Smalley, Moffitt, USA Carolina Catarino PhD Student Paula Pennacchi PhD Tatiana Pedrosa PhD Student Thalita Zanoni, PhD