Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau (Theobroma cacao L.) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes envolvidos.

Apresentação em tema: "Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau (Theobroma cacao L.) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes envolvidos."— Transcrição da apresentação:

1 Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano na Parede Celular de Cacau (Theobroma cacao L.) e análise da Expressão Tecido-Específica de genes envolvidos nas Reações de Reciclagem de Grupos Metil durante a Doença Vassoura-de-Bruxa Orientador: Prof. Dr. Gonçalo A. G. Pereira Co-orientadora: Dra. Maria Carolina Sacatolin do Rio Aluno: Gleidson Silva Teixeira

2 Tópicos da Apresentação
Introdução A Vassoura-de-bruxa Parede celular primária Homogalacturonano (HGA) Reciclagem de metil via SAM (S-adenosil-L-metionina) Objetivos Metodologia Resultados preliminares Próximos passos

3 Introdução A Vassoura-de-Bruxa
Agente etiológico: Moniliophthora perniciosa Evolução e sintomas da doença

4 Parede celular primária
Introdução Parede celular primária Implicações no desenvolvimento vegetal Defesa contra a invasão por microrganismos Zeiger, T. Plant Physiology 3ed 2005.

5 (1→4)-α-linked-D-galacturonic acid
Introdução Domínios pécticos (1→2)-α-L-rhamnose-(1→4)-α-D-galacturonic acid Willats, WGT et al. Plant Molecular Biology 2001a. (1→4)-α-linked-D-galacturonic acid

6 (1→4)-α-linked-D-galacturonic acid
Introdução Homogalacturonano (HGA) (1→4)-α-linked-D-galacturonic acid Ridley, BL et al. Phytochemistry 2001. 1 4 6 6 3 2

7 Homogalacturonano (HGA)
Introdução Homogalacturonano (HGA) Willats, WGT et al. Planta 2001b. Ocorrência de GalA não metilado na superfície de células epidermais e radícula Regiões de-metiladas restritas a junções celulares

8 Reciclagem de grupos metil
Introdução Reciclagem de grupos metil Índice de metil SAM:SAH SAM Synthase ACC Synthase ACC Oxidase ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylate) demethylesterification PME Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.

9 Alterações na atividade de HGA-MT
Introdução Alterações na atividade de HGA-MT Mouille, G et al., The Plant Journal 2007. PAM1 Qua2 Krupková, E et al., The Plant Journal 2007. TSD2

10 (1-aminocyclopropane-1-carboxylate)
Introdução Reciclagem de grupos metil SAM Synthase ACC Synthase ACC Oxidase ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylate) demethylesterification PME (-) Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.

11 Alterações na atividade de SAHH
Introdução Alterações na atividade de SAHH

12 (1-aminocyclopropane-1-carboxylate)
Introdução Reciclagem de grupos metil SAM Synthase ACC Synthase ACC Oxidase ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylate) demethylesterification PME (-) (-) Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.

13 Alterações na atividade de ADK
Introdução Alterações na atividade de ADK Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002. Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.

14 Alterações na atividade de ADK
Introdução Alterações na atividade de ADK Pereira, LAR et al., Planta 2006b. (10% ADK activity) LM7

15 Alterações na atividade de SAMS
Introdução Alterações na atividade de SAMS SAMS Aumento da atividade de SAMS Acúmulo de SAM e SAH

16 (1-aminocyclopropane-1-carboxylate)
Introdução Reciclagem de grupos metil SAM Synthase ? ACC Synthase ACC Oxidase ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylate) demethylesterification PME Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.

17 SAM com precursor de etileno
Introdução SAM com precursor de etileno Scarpari, LM et al. J Exp Bot 2005.

18 (1-aminocyclopropane-1-carboxylate)
Introdução Reciclagem de grupos metil SAM Synthase ACC Synthase ACC Oxidase ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylate) demethylesterification PME Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.

19 Alterações na atividade de PMEs
Introdução Alterações na atividade de PMEs Lionett, V et al., Plant Physiology 2007.

20 Objetivos do projeto Caracterização do domínio péctico HGA;
Análise da expressão de genes envolvidos nas reações de reciclagem de metil via SAM

21 Metodologia Experimento em casa de vegetação Hibridização in situ
Imunolocalização Escolha dos genes e síntese de primers Fixação em FAA Extração de RNA Fixação em Karnovsky Escolha dos epítopos Síntese de cDNA e amplificação Clonagem e seqüenciamento Linearização e transcrição in vitro Desidratação e inclusão Microtomia e montagem Escolha das lâminas Desidratação e Inclusão Microtomia e montagem Escolha das lâminas Definição dos anticorpos primários Síntese de anticorpos secundários Fotografia Interpretação dos resultados Fotografia

22 Resultados preliminares
SAM Synthase ACC Oxidase ACC demethylesterification PME JIM5 – JIM7 PAM1 QUA1 e QUA2

23 Extração de RNA Resultados preliminares M. musculus T. cacao T. cacao
28S rRNA 18S rRNA

24 Síntese de cDNA e amplificação por PCR
Resultados preliminares Síntese de cDNA e amplificação por PCR Qua1 Qua2 PME SAHH ADK SAMS CaffMT Accox 50bp 200bp

25 Clonagem Resultados preliminares 200bp 200bp 200bp 200bp
50bp Qua1 Qua2 PME SAHH ADK SAMS CaffMT Accox 200bp Clonagem 50bp PME 50bp ADK ADK 200bp 200bp 200bp

26 Seqüenciamento Resultados preliminares 400bp
100bp Qua1 Qua2 PME SAHH ADK SAMS CaffMT Accox 400bp M13 F 2949 M13 R 197

27 Resultados preliminares

28 Linearização do plasmídeo
Resultados preliminares Linearização do plasmídeo SAHH Não dig. SAHH AS (ApaI) ADK Não dig. ADK S (SalI) λ hind III λ hind III Não dig. S (ApaI) AS (SalI) 4361bp 4361bp ~ 3233bp ~ 3237bp ~ 3233bp 2322bp 2322bp

29 Próximas etapas Transcrição in vitro (síntese da sonda)
Confecção das lâminas para a hibridização Hibridização in situ Real-Time PCR ou PCR semi-quantitativo Confecção das lâminas para a imunolocalização Imunolocalização

30 Próximas etapas BCIP/NBT Digoxigenin