ASPECTOS BIOQUÍMICOS do proteassoma Trabalho realizado por: Mariana Barrêto João Pedro Barros Ana Teresa Belo Ana Paula Borges João Bragada Rita Branquinho Joana Brito Ricardo Daniel Brito Carolina Cabaços Rita Cabral Diana Cadete Maria Inês Canha Diogo Canhoto Andreia Cardoso Seminário Orientado de Bioquímica 19 de Outubro de 2011

Índice 2) Explicação da importância bioquímica deste sistema 1) Descrição do sistema ubiquitina-proteassoma O que é? Qual a sua importância? Função da ubiquitina Como ocorre a ubiquitinação? Estrutura e função do proteassoma 2) Explicação da importância bioquímica deste sistema Onde actua? Alguns exemplos 3) Exemplos de desregulação deste sistema: possíveis patologias associadas As doenças de Alzheimer, Parkinson e o HPV

Como é que as proteínas são eliminadas? Toda a gente sabe que as proteínas que já não são úteis para o organismo não permanecem nele para sempre. Mas como é que elas são eliminadas? Pois bem, foi precisamente em 2004 que se atribuiu o prémio Nobel da Química a 3 investigadores que desvendaram como ocorre o processo de degradação celular de proteínas mediado por ubiquitina. Mas o que será isto da ubiquitina? E como é que ela actua?

1- Descrição do sistema ubiquitina - proteassoma Ora a ubiquitina não actua sozinha, mas sim num sistema complexo denominado sistema ubiquitina-proteassoma. Porém, antes de iniciarmos a sua descrição propriamente dita, é fundamental que nos familiarizemos com alguns conceitos que iremos encontrar ao longo deste trabalho.

1- Descrever o sistema ubiquitina-proteassoma O que é? Proteassoma 1% das proteínas da célula eucariótica Os proteassomas são complexos proteicos de grandes dimensões, presentes em todos os eucariontes e em alguns procariontes sob a forma de estruturas homólogas, dispersos no citoplasma da célula e no núcleo, mas mais concentrados no centrossoma. Constituem quase 1% das proteínas da célula eucariótica, tendo uma concentração comparativamente superior às outras proteínas celulares. A sua função é degradar proteínas marcadas quimicamente pela ubiquitina, como iremos ver mais à frente. Complexo proteico de grandes dimensões Presente no citoplasma (e núcleo) das células FUNÇÃO: degradar as proteínas marcadas quimica-mente pela ubiquitina, transformando-as em péptidos.

1- Descrever o sistema ubiquitina-proteassoma O que é? Ubiquitina A ubiquitina é uma proteína de pequenas dimensões comum a todas as células eucarióticas constituída por 76 aminoácidos, dispersa no citoplasma ou ligada a outras proteínas celulares e que foi bastante conservada entre os organismos eucariontes. Esta proteína vai funcionar como marcador das proteínas a degradar. Pequena proteína – cerca de 76 aminoácidos Presente em todas as células eucarióticas FUNÇÃO: marcar proteínas para degradação

1- Descrever o sistema ubiquitina-proteassoma Qual a sua importância? “Protein Turnover” Síntese Enzimática Degradação Enzimática Cada célula tem as suas necessidades metabólicas e necessidade de homeostasia, que é satisfeita à custa da degradação e síntese de proteínas. O equilíbrio entre a síntese e a degradação enzimática é o turnover, que é essencial no house keeping da célula. Este é especialmente activo em tecidos ou órgãos que estão em processo acelerado de diferenciação ou sujeitos a situações de stress (e.g. cirurgia, trauma, queimaduras, infecções). equilíbrio entre

1- Descrever o sistema ubiquitina-proteassoma Qual a sua importância? Degradação nos proteassomas Proteínas de semi-vida curta Proteínas danificadas Proteínas que deixa-ram de ser funcionais ATP As proteínas que são alvo de degradação são usualmente: proteínas que deixaram de ser funcionais (por misfolding ou erros na tradução do RNA), proteínas danificadas (por oxidação por exemplo) e proteínas semi-vida curta (importantes na actividade metabólica). Deste processo resultam aminoácidos, alguns dos quais necessários para o organismo e não sintetizados por ele – aminoácidos essenciais. Estes são usados em síntese proteica ou em bases nucleotídicas (visto terem azoto na sua constituição). Importantes para o organismo (ex: aminoácidos essenciais)

1- Descrever o sistema ubiquitina-proteassoma Função da ubiquitina No citosol Diminuir a taxa de dissociação entre proteassomas e proteínas-substrato Marcar as proteínas que precisam de ser degradadas. Diminuir a taxa de dissociação entre proteassomas e proteínas-substrato que interagem. Ou seja, sem a Ub, as proteínas poderiam interagir com o proteassoma, mas rapidamente se dissociariam. A Ub atrasa esta dissociação, aumentando assim a probabilidade de o proteassoma a degradar. Marcar as proteínas para degradação Proteassoma liga-se à proteína marcada

1- Descrever o sistema ubiquitina-proteassoma Como ocorre a ubiquitinação? Ubiquitina Cyclin Destruction Boxes PEST sequences Proteínas para degradação Hidrólise de ATP A ubiquitina liga-se covalentemente a proteínas que têm sequências de aminoácidos específicas - cyclin destruction boxes ou PEST sequences, através da hidrólise de ATP. A ubiquitinação, ou seja, a ligação da ubiquitina, também depende do terminal N das proteínas (que está relacionado com a meia-vida das proteínas), que pode ou não favorecer esse processo. Arg–Thr–Ala–Leu–Gly–Asp–Ile–Gly–Asn Pro-Glu-Ser-The

1- Descrever o sistema ubiquitina-proteassoma Como ocorre a ubiquitinação? Esta ligação é catalisada por três enzimas: E1 – Enzima activadora da ubiquitina E2 – Enzima conjugadora da ubiquitina E3 – Ubiquitina ligase Requer a actuação de três enzimas: E1 – enzima activadora da ubiquitina E2 – enzima conjugadora da ubiquitina E3 – ubiquitina ligase

1- Descrever o sistema ubiquitina-proteassoma ACTIVAÇÃO: A Ub é activada pela E1 Hidrólise de ATP Como ocorre a ubiquitinação? Activação: E1 activa a molécula de ubiquitina, ligando-se a ela com utilização de energia proveniente da hidrólise ATP.

1- Descrever o sistema ubiquitina-proteassoma TRANSFERÊNCIA: A Ub activada liga-se à E2 Forma-se o complexo E2-ubiquitina A E1 liberta-se Como ocorre a ubiquitinação? Transferência: A ubiquitina é transferida para E2, formando o complexo E2–ubiquitina e libertando-se E1.

1- Descrever o sistema ubiquitina-proteassoma UBIQUITINAÇÃO: Complexo E2-ubiquitina liga-se a E3 Ligação isopeptídica entre a ubiquitina e a proteína- alvo E2 e a proteína ubiquitinada separam-se de E3 RECONHECIMENTO: E3 reconhece e liga-se à proteína-alvo Como ocorre a ubiquitinação? Reconhecimento: A enzima E3 reconhece e liga-se à proteína-alvo. Ubiquitinação: O complexo E2-ubiquitina liga-se a E3 e a ubiquitina é transferida de E2 para o alvo. A ligação entre a proteína-alvo e a ubiquitina é isopeptídica, feita entre o grupo carboxilo da glicina presente na ubiquitina e os grupos ε –amino dos resíduos de lisina das proteínas a degradar. Depois, E2 e a proteína ubiquitinada separam-se de E3.

1- Descrever o sistema ubiquitina-proteassoma POLIUBIQUITINAÇÃO: O processo pode repetir-se, sendo destruídas novas proteínas Como ocorre a ubiquitinação? Poli-ubiquitinação: Esta adição de cadeias de ubiquitina à proteína-alvo pode repetir-se, sendo destruídas novas proteínas.

1- Descrever o sistema ubiquitina-proteassoma Função e estrutura do proteassoma Unidade reguladora Unidade catalítica LIGAÇÃO Proteassoma – função: destruir as proteínas ligadas à ubiquitina O proteassoma 26S (o mais comum de todos) é constituído por duas unidades: - unidade reguladora (19S) – assegura que só as cadeias poliubiquitinadas (com 4 ou mais moléculas de Ub) são degradadas através das ATPases, que: actuam como unfoldases à semelhança da DNA helicase (para que a proteína possa ser passado para o centro do proteassoma) induzem mudanças de conformação da unidade catalítica, de modo que a proteína marcada possa ligar-se à mesma - unidade catalítica (20S) – é a estrutura central. Nesta unidade o substrato (proteína marcada) é degradado até que a proteína inicial seja reduzida a produtos peptídicos (de 7-9 aminoácidos) que posteriormente são reduzidos a aminoácidos por outras proteases celulares. A ubiquitina é depois reciclada pelas enzimas de desubiquitinação. UNFOLDING DEGRADAÇÃO Proteassoma S26 (mais comum)

2- Explicar a importância bioquímica do sistema ubiquitina-proteassoma Nas células eucarióticas, a principal via de degradação de proteínas não ocorre nos lisossomas – ela é dependente de ATP e de ubiquitina, tratando-se, pois, do sistema ubiquitina-proteassoma, que foi já explicado no tópico anterior.

2- Importância bioquímica do sistema Onde actua? Numerosos processos celulares regulados por este sistema incluem, por exemplo, o ciclo celular, reparação de DNA, etc, como se pode ver na seguinte figura (no ppt). Poderíamos falar de inúmeras funções do sistema ubiquitina-proteassoma, esclarecendo desta forma a importância bioquímica deste sistema. No entanto, iremos centralizar a nossa atenção em três exemplos bastante significativos: controlo do ciclo celular, regulação da transcrição (síntese de mRNA) e reparação do DNA.

Controlo do ciclo celular 2- Importância bioquímica do sistema Controlo do ciclo celular G1  S Para ocorrer a iniciação da replicação do DNA é necessário que um inibidor de uma cinase seja degradado Sofre fosforilação Reconhecimento pela E3 como substrato Ubiquitinação e degradação do inibidor pelo proteassoma A via proteolítica dependente de ubiquitina/proteassoma desempenha um papel muito importante pelo menos em três períodos do ciclo de divisão celular. Na transição G1/S, a iniciação da replicação do DNA é desencadeada pela degradação de um inibidor de uma cinase dependente de ciclina. Quando este inibidor sofre fosforilação, uma E3 reconhece-o como substrato ocorrendo ubiquitilação e subsequente degradação.

2- Importância bioquímica do sistema Controlo do ciclo celular Anafase Securina Inibidor da separina que sofre ubiquitinação e, posteriormente, degradação pelo proteassoma, para permitir a separação dos cromatídeos. FALTA DE CONTROLO NO CICLO CELULAR: TUMORES! Durante a mitose, na anafase, a securina, um inibidor da separina (uma endoprotease envolvida na separação dos cromatídeos), sofre ubiquitilação sendo depois degradada pelo proteassoma. Na fase final da mitose (telofase) as ciclinas características desta fase, bem como factores que controlam a desmontagem do fuso mitótico sofrem degradação pela via proteolítica dependente de ubiquitina/proteassoma. É de notar que a falta de controlo do ciclo de divisão celular está implicada no desenvolvimento de tumores. Telofase Ciclina Proteína característica desta fase que, tal como os factores que controlam a degradação do fuso mitótico, sofre ubiquitinação e degradação pelo proteassoma.

2- Importância bioquímica do sistema Regulação da transcrição Síntese do mRNA É catalisada pela polimerase II Depende de vários factores de transcrição A síntese do RNA mensageiro nos eucariotas é catalisada pela enzima RNA polimerase II e depende de muitos factores de transcrição que controlam a sua actividade. Uma forma de regular o nível de certos factores de transcrição é através da sua ubiquitilação e subsequente degradação pelo proteassoma. Ubiquitinação e subsequente degradação pelo proteassoma

2- Importância bioquímica do sistema Reparação do DNA Pertence à via dependente da ubiquitina Enzima Ubc2 (E2 de levedura) Proteína Rad6 A enzima Ubc2 (uma das treze E2 de levedura) foi a primeira enzima da via dependente de ubiquitina a ser relacionada com uma função fisiológica, devido à sua identidade com a proteína Rad6 – componente essencial na reparação do DNA: participa na mono-ubiquitilação de uma subunidade da DNA polimerase (PCNA) envolvida na síntese e reparação do DNA. Componente essencial na reparação do DNA (mono-ubiquitilação de uma subu-nidade da DNA polimerase: PCNA)

3- Exemplos de desregulação deste sistema: possíveis patologias associadas O terceiro objectivo do nosso trabalho consiste em indicar exemplos de desregulações que podem ocorrer no sistema ubiquitina-proteassoma, e abordar algumas patologias associadas a esse incorrecto funcionamento do sistema.

3 - Desregulação do sistema e patologias associadas A desregulação do sistema ubiquitina-proteassoma pode levar a consequências nefastas no organismo, nomeadamente patologias: neurodegenerativas neoplásicas. A desregulação do sistema ubiquitina-proteassoma pode levar a consequências no organismo conduzindo, nomeadamente, a patologias essencialmente neurodegenerativas (problemas nos sistemas nervosos central e periférico) e neoplásicas (cancros – benignos e malignos).

3 - Desregulação do sistema e patologias associadas Alzheimer Parkinson Virus do Papiloma Humano (HPV) Huntington Esclerose Amiotrófica Lateral (ALS) Cancro Colorrectal Cervical Algumas das patologias associadas à desregulação do sistema ubiquitina-proteassoma são: Alzheimer Parkinson Vírus do Papiloma Humano (HPV) Huntington Esclerose amiotrófica lateral (ALS) Cancro Colorrectal Cancro Cervical De todas estas patologias, decidimos abordar em maior profundidade a doença de Alzheimer, Parkinson e o Vírus do Papiloma Humano (HPV) pois considerámo-las as mais interessantes e, como são das mais prevalentes na população, na nossa vida futura certamente teremos de contactar com elas sendo então importante saber como podem ser desencadeadas.

3 - Desregulação do sistema e patologias associadas Alzheimer Doença neurode-generativa do SNC SINTOMAS: Perda da memória Perda das capacidades cognitivas Proteína Tau hiperfosforilada Proteína β-amilóide MORTE NEURONAL Alzheimer: É uma doença crónica neurodegenerativa que afecta o SNC (Sistema Nervoso Central), ou seja, o cérebro. Alguns dos seus sintomas são a perda de memória e das capacidades cognitivas, e afecta essencialmente pessoas idosas. É causada pela degeneração progressiva das células do tecido nervoso. Esta ocorre porque, devido ao mau funcionamento do sistema ubiquitina-proteassoma ou devido à alteração estrutural de proteínas (que impede a sua destruição), se verifica uma acumulação progressiva de proteína Tau hiperfosforilada que, em conjunto com a proteína β-amilóide, promove a morte dos neurónios.

3 - Desregulação do sistema e patologias associadas Parkinson Pode ser provocada por uma mutação nos genes que codificam as proteínas Parkina e UCH-L1 (proteínas-chave) Doença neurodegenerativa SINTOMAS: Rigidez Tremuras Dificuldades na locomoção Anomalia no funcionamento do sistema ubiquitina-proteassoma Degradação pouco eficiente Acumulação de proteínas Formação de corpos de Lewy Parkinson: Tal como Alzheimer, é uma doença neurodegenerativa. Provoca rigidez, tremuras e dificuldades na locomoção. Pode ser causada por: Apenas uma anomalia no sistema ubiquitina-proteassoma, não ocorrendo a degradação de proteínas não desejadas que, acumulando-se no interior das células, formam os Corpos de Lewy (agregação e acumulação anormal de uma proteína); No entanto, existem duas “proteínas-chave”, a proteína Parkina e a proteína UCH-L1, sendo que uma mutação em qualquer um dos genes que as codificam pode desencadear um mau funcionamento no sistema ubiquitina-proteassoma, levando às mesmas consequências que acabei de descrever.

3 - Desregulação do sistema e patologias associadas HPV Vírus do Papiloma Humano SINTOMAS: Afecta a pele e mucosas, provocando- -lhes lesões 1) Produz uma proteína que activa uma E3 específica 2) Degradação de proteínas supressoras de tumores e reparadoras de DNA 3) Impedimento da reparação celular e apoptose 4) Aparecimento e proliferação de tumores Vírus do Papiloma Humano (HPV): O HPV consiste num vírus que afecta a pele e mucosas provocando-lhes lesões.   1º - O vírus manipula o sistema ubiquitina-proteassoma pois produz uma proteína (E6-AP) que activa uma E3 específica. 2º - A E3 activada conduz à ubiquitinação, e posterior degradação por parte do proteassoma, de proteínas supressoras de tumores e reparadoras de DNA (como a proteína p53). 3º - Sem estas proteínas, a reparação e apoptose celulares não podem ocorrer. 4º - Assim, é favorecido o aparecimento e a proliferação de tumores.

Bibliografia http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc20/v20a03.p df (Nobel) FALTA FAZER – eu não tinha as referências todas