ESPECTROSCOPIA NA LUZ VISÍVEL E ULTRAVIOLETA

ESPECTROSCOPIA NA LUZ VISÍVEL E ULTRAVIOLETA 1) Introdução: Identificação de compostos orgânicos , inorgânicos e íons Análise quantitativa de alguns grupos funcionais orgânicos Determinação quantitativa de espécies orgânicos, inorgânicos e biológicos

Existem vários métodos espectrofotométricos em análise de alimentos: Colorimetria – visa determinar a concentração de uma substância, em condições bem definidas, pela medida da absorção da luz, tornando referência a absorção da substância numa concentração definida.

Métodos Espectrofotométricos Método analítico sensível Rápido Resultados precisos Utilizada na determinação da concentração dos constituintes do alimento

Métodos Colorimétrico Leitura dos valores de absorbância de soluções padrões de concentrações conhecidas Curva padrão Determinação da concentração de uma determinada substância presente na amostra

2) Fundamentação Teórica

Radiação Eletromagnética 2.1 Radiação Eletromagnética Ondas eletromagnética: campos oscilantes elétrico (E) e magnético (M)

A radiação eletromagnética se propaga numa velocidade constante, mas depende do índice de refração meio que atravessa Equações

Requisitos para que uma radiação seja absorvida por uma molécula: A radiação incidente deve ter a mesma freqüência da freqüência rotacional, vibracional, eletrônica ou nuclear da molécula A molécula deve ter um dipolo permanente ou um dipolo induzido, isto é, deve haver alguma coisa para a energia absorvida fazer: DEVE SER FEITO UM TRABALHO (TRANSIÇÃO, ROTAÇÃO E VIBRAÇÃO)

2.2 Espectrometria de absorção nas regiões ultravioleta (UV) e Visível O espectro de energia radiante é dividido em várias regiões e seus limites foram determinados por limites práticos de métodos experimentais apropriados de produção e detecção de radiação. Diferentes regiões espectrais têm significado na interações físicas. A região do espectro do ultravioleta é na faixa de 200 a 400 nm e a da luz visível é entre 400 e 700 nm. Transições dos elétrons de valência

2.2 Espectrometria de absorção nas regiões ultravioleta (UV) e Visível Em análise, o importante das soluções coloridas ou incolores é que a radiação absorvida é uma característica da amostra absorvente Espectros (UV) e Visível resultado de transições eletrônicas (elétrons da camada de valência)

2.2 Espectrometria de absorção nas regiões ultravioleta (UV) e Visível Radiação contínua de luz branca atravessa a amostra Intensidade da radiação vai decrescer A radiação emergente poderá ser colorida (região visível, porque na região do visível veremos a cor da radiação emergente

2.2 Espectrometria de absorção nas regiões ultravioleta (UV) e Visível Exemplo: amostra absorve luz de comprimento de onda da luz azul radiação emergente é seu complemento, que é a luz amarela. Corante TARTRAZINA Cor é amarela, pois a solução está absorvendo o complemento do amarelo que é o azul (430 nm), sendo transparente para as demais cores.

2.2 Espectrometria de absorção nas regiões ultravioleta (UV) e Visível Qualquer material solúvel pode colorido pode ser analisado quantitativamente deste modo BASE DA ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO VISÍVEL Transformar uma substância incolor ou pouco colorida em colorida através de reações químicas e analisá-las BASE DA COLORIMETRIA

COLORIMETRIA Exemplo: Determinação de Fósforo Reação colorimétrica (solução de molibdato de amônia + metavanadato de amônia) Formação de um complexo de cor amarela * radiação absorvida deve ser complementar a amarela, que é a radiação azul com comprimento de onda entre 450 – 480 nm * leitura da absorbância máxima para este complexo será de 470nm

2.2 Espectrometria de absorção nas regiões ultravioleta (UV) e Visível Substâncias incolores Podem ser analisadas diretamente sem nenhuma reação colorimétrica através de radiação ultravioleta (UV) BASE PARA RADIAÇAO ULTRAVIOLETA Exemplo: Conservantes de alimentos ácido benzóico e ácido sórbico – são incolores e não existe nenhuma reação colorimétrica para torná-los coloridos

2.2 Espectrometria de absorção nas regiões ultravioleta (UV) e Visível Radiação das regiões do visível e UV Suficiente apenas para causar a excitação dos elétrons das camadas externas (de valência) - Sigma (σ) : ligações simples C-C Ligações muito fortes absorção na região do UV é difícil Compostos saturados: propano 135 nm

2.2 Espectrometria de absorção nas regiões ultravioleta (UV) e Visível Radiação das regiões do visível e UV Suficiente apenas para causar a excitação dos elétrons das camadas externas (de valência) Pi: ligações dupla C= C Ligações mais fracas possuem grande absorção nas regiões do visível e UV Ex: Carotenóides absorvem na região do visível (380 – 700 nm)

2.2 Espectrometria de absorção nas regiões ultravioleta (UV) e Visível Radiação das regiões do visível e UV Suficiente apenas para causar a excitação dos elétrons das camadas externas (de valência) Elétrons que não são de ligação os orbitais atômicos – elétrons não ligantes (n): elementos como O, S etc. Transição de n σ são mais difíceis e se dão na UV do vácuo – Exemplo: anel benzeno, absorve na região UV (200 – 380 nm)

2.2 Espectrometria de absorção nas regiões ultravioleta (UV) e Visível Absorção nas regiões do visível e UV Ligações dupla conjugadas, com transições eletrônicas П П CROMÓFOROS – grupos dos compostos que possuem estas características e absorvem radiação UV/Visível * Transições n П intensidade dos espectro é fraca

2.3 Lei de Beer-Lambert - Lambert estudou a transmissão da luz por sólidos homogêneos. - Beer estendeu o trabalho de Lambert ao estudo de soluções. Através dessa lei: intensidade da radiação incidente e emergente podem ser relacionadas com as concentrações do material presente na amostra.

2.3 Lei de Beer-Lambert quadro

2.3 Lei de Beer-Lambert Considerações: São consideradas desprezíveis os efeitos de reflexão, difusão e fluorescência. Radiação incidente deve ser monocromática conter somente um comprimento de onda.

Espectroscopia de Absorção É preciso determinar a quantidade de luz que a amostra irá absorver, sendo descrito pela Lei de Beer-Lambert que é a relação entre a intensidade da luz incidida na solução (P0) e a intensidade da luz saindo da solução (P). -log (P/Po) = A = abc A = absorvância a = absortividade molecular ou coeficiente de extinção c = concentração do material absorvedor l = espessura da amostra através da qual a luz passa (largura da cubeta) Pela Lei de Beer podemos concluir que a absorvância de uma solução é diretamente proporcional à concentração da espécie absorvente quando se fixa o comprimento

Espectroscopia de Absorção -log (P/Po) = A = abc A = absorvância a = absortividade molecular ou coeficiente de extinção c = concentração do material absorvedor b = espessura da amostra através da qual a luz passa (largura da cubeta) Pela Lei de Beer podemos concluir que a absorvância de uma solução é diretamente proporcional à concentração da espécie absorvente quando se fixa o comprimento do percurso; e diretamente proporcional ao comprimento do percurso quando se fixa a concentração

Espectroscopia de Absorção Assim a definição da absorvância nas condições da validade da lei de Lambert-Beer é uma quantidade proporcional à concentração. O espectrofotômetro se torna um medidor e concentração seletivo para uma determinada substância, através da relação: C = A/ab A = absorvância a = absortividade molecular ou coeficiente de extinção c = concentração do material absorvedor b = espessura da amostra através da qual a luz passa (largura da cubeta)

Desvios da Lei de Beer-Lambert Desvios Químicos: Mudanças na concentração da solução por interação das moléculas do soluto entre si e com o solvente, através dos efeitos de associação ou dissociação. Pode ser evitado trabalhando com soluções diluídas (0,01M)

Desvios da Lei de Beer-Lambert Desvios Instrumentais: A iluminação não é monocromática, isto é, de um único comprimento de onda O sinal do detector não é linear nem proporcional a concentração da solução.

Análise Qualitativa A identificação do composto é feita através da comparação com padrões do valor do comprimento de onda O solvente escolhido deve ser transparente na região escolhida (máximos de absorção afetadas pela natureza do solvente)

Análise Quantitativa Quantidade do composto medida pelo valor de absorvância máxima (topo de um pico de absorção) Razões: A variação na absorvância para uma dada mudança de concentração será maior, resultando em sensibilidade e precisão maiores O efeito relativo de outras impurezas é minimizado A mudança da absorvância com o comprimento de onda é menor devido ao espectro de absorção médio ser relativamente plano no topo do pico. Logo a medida não é seriamente afetada por pequenos erros de ajuste do comprimento de onda.

Análise Quantitativa Quantidade do composto medida pelo valor de absorvância máxima (topo de um pico de absorção) Conclusão; A escolha do comprimento de onda (λ) máximo deve ser onde haja máxima absorvância (A) e, consequentemente, mínima transmitância (T)

Cálculos da Concentração (C), Utilizando a Lei de Beer A) Com valor de absortividade (a) da amostra conhecido: Usar a Lei de Beer-Lambert: A= abc, e tirar o valor de c A = absorvância a = absortividade molecular ou coeficiente de extinção c = concentração do material absorvedor b = espessura da amostra através da qual a luz passa (largura da cubeta)

Cálculos da Concentração (C), Utilizando a Lei de Beer Com o valor de absortividade (a) da amostra desconhecido: - Fazer a curva padrão - Leva-se o valor da máxima absorvância da amostra para uma curva padrão construída com concentrações diferentes e tira-se a concentração do composto analisado. - Importante verificar a linearidade da resposta em relação à curva padrão pois, acima de uma certa concentração , a relação AxC deixa de ser linear (o gráfico é uma reta)

Espectrofotômetro Instrumento que registra dados de absorbância em função do comprimento de onda (λ). A característica mais importante do espectrofotômetro é a seleção de radiações monocromáticas. O espectro de absorção é característico para cada espécie química, sendo possível a identificação de uma espécie química através do seu espectro de absorção.

Esquema dos principais componentes de um espectrofotômetro A amostra deve estar em um recipiente (cubeta) de quartzo quando a radiação for na região espectral do ultravioleta. Quando for na região da luz visível usa-se os de vidro por ter uma melhor dispersão. Os detectores devem ser altamente sensíveis. Os dados obtidos pelo detector são enviados para um dispositivo de processamento de dados.

Fontes de Radiação As fontes mais comuns baseiam-se na incandescência, mas devem atuar em temperaturas elevadas para ter uma cobertura apreciável no ultravioleta. São constituídas por filamentos de materiais que são excitados por descargas elétricas com elevada voltagem ou aquecimento elétrico. Tipos: Lâmpada com descarga de hidrogênio: utilizada na região UV Lâmpada de tungstênio: utilizada na região visível

Fontes de Radiação Condições para uma fonte ser de boa qualidade para atuar nessa faixa:  gerar radiação contínua;  ter intensidade de potência radiante suficiente para permitir a sua detecção pelo sistema detector;  ser estável. Além disso deve ter um tempo de vida longo e preço baixo.

Monocromadores Função: seleção do comprimento de onda em que se tem interesse para a análise. Constituição:  fenda de entrada de um elemento de dispersão de radiação  fenda de saída Tipos:  prismático  reticuladores

Monocromador Prismático A radiação policromática vinda da fonte de radiação passa pela fenda de entrada e incide sobre a face de um prisma, sofrendo um desvio. Os vários comprimentos de onda terão diferentes direções após a incidência no prisma. Se for realizado um ajuste rigorosamente controlado da fenda de saída, pode-se selecionar o comprimento de onda desejado.

Monocromador Prismático

Monocromador Reticular O principal elemento dispersante é a rede de difração. Essa rede consiste em uma placa transparente ou refletora com muitas ranhuras paralelas e equidistantes. Dispersão resultante desta rede é linear. Os vários comprimentos de onda dispersos são igualmente espaçados, por isso a fenda de saída isolará uma banda de radiação de largura constante. A resolução é muito mais elevado que os prismas.

Monocromador Reticular

Tipos de Espectrofotômetros para a Região Visível e Ultravioleta Espectrofotômetro mono-feixe :

a) Fonte: fonte de radiação b) Monocromador: selecionar uma banda ou um único comprimento de onda c) Cela para a amostra: cubetas Região visível: material transparente como vidro ou plástico Região ultravioleta: não pode ser de vidro, porque ele absorve radiação nesta região, sendo utilizada a cubeta de quartzo, que é mais cara

d) Detector Fotocélulas que detectam a quantidade de radiação transmitida após a passagem pela amostra, porém o resultado pode ser convertido em quantidade de radiação absorvida pela amostra. e) Amplificador Amplificação da resposta (fótons-multiplicadores) Fóton da radiação passa pelo amplificador e é registrado com maior número de elétrons f) Registrador Registrador transforma o sinal elétrico que chega ao detector e amplificador em energia mecânica fazendo o registrador mover-se,

Solvente : Região visível: qualquer líquido que não tenha cor, e o mais usado é água estilada. Região UV: qualquer solvente que não absorva nesta região, que não tenha duplas ligações conjugadas, como, por exemplo, a água ou hidrocarbonetos saturados.

Etapas: 1º) Coloca-se o solvente (branco) no caminho ótico e mede-se a intensidade da energia radiante,que atinge o detector; 2º) Substitui-se o recipiente com o solvente (branco) pelo recipiente com a amostra e faz- se a determinação propriamente dita da absorbância.

Espectrofotômetros mono-feixe: - Não são cômodos pois a amostra e o branco tem que ser colocados alternadamente no único feixe de radiação; - mais simples e baratos - não registra espectro

Espectrofotômetro duplo-feixe Dois feixes de radiação são formados no espaço, por um espelho que divide o feixe vindo do monocromador em dois. Um feixe passa através da solução referencia (branco) até o transdutor e outro, ao mesmo tempo, passa através da amostra até o segundo transdutor. As duas correntes serão determinadas e mostradas no indicador de sinal. Com o auxílio de um dispositivo apropriado, calcula-se a diferença de transmitância entre os dois feixes, essa diferença será mostrada no indicador de sinal como absorvância – REGISTRA APENAS O ESPECTRO DA AMOSTRA

Espectrofotômetro duplo-feixe

Espectrofotômetro duplo-feixe