UPCII M Microbiologia Teórica 23-24 2º Ano 2013/2014

Sumário E. Patologia Oral de Etiologia Microbiana Capítulo XIX. Cárie Etiologia Bacteriana da cárie Modelos animais Imunologia da cárie e vacinas Aplicação de técnicas moleculares ao estudo da cárie Implicações para terapêutica T 23-24 MJC 20-11-2013

Cárie – O que é? saliva T 23-24 MJC 20-11-2013

Progressão da carie T 23-24 MJC 20-11-2013

Tipos de carie Da superfície do dente Das fissuras ou zonas interproximais Radicular Recidiva Rampante Carie de biberão T 23-24 MJC 20-11-2013

adesinas PECs Etiologia Bacteriana Streptococci: S. mutans: mutans sanguinis gordonii sobrinus salivarius mitis anginosus .... S. mutans: a  S. cricetus b  S. ratti (us) c  S. mutans d S. sobrinus e S. mutans f S. mutans g S. sobrinus Grupo IV Grupo II Grupo I Grupo III adesinas PECs T 23-24 MJC 20-11-2013

Além dos streptococci …. Lactobacilli (dificuldade em colonizar superfícies lisas) Actinomyces Bifidobacterium, Propionobacterium, Veillonella, Attopobium Atopobium, Olsenella, Pseudoramibacter, Propionibacterium e Selenomonas Rothia, Propionibacterium Cárie tem Microbiologia COmplexa T 23-24 MJC 20-11-2013

Factores de Virulência de Streptococci T 23-24 MJC 20-11-2013

Factores de virulência de streptococci T 23-24 MJC 20-11-2013

Glucanos e Frutanos T 23-24 MJC 20-11-2013

Glucanos e Frutanos T 23-24 MJC 20-11-2013

Metabolismo da sacarose por S.mutans Glucosiltransferase Fructosiltransferase Glucanos alfa(1,3) e alfa(1,6) + Frutose Fructanos beta(2,1) e beta(2,6) + Glicose Fructanase Dextranase Glicose Glicólise PSI 20-11-2013 T 23-24 MJC

Factores de virulência de S. mutans Função Localização SpaP (AgB, AgI/II), PI Aderência (saliva, aglutinina gp340) Superficie da célula Proteinas de ligação ao glucano (GbpA-C) Aderência aos glucanos (dentes e biofilme) Superfície da célula Glucosyl transferases (GtfB-D) Produção de polímeros de glicose apartir da sacarose (glucanos) Secretadas, muitas vezes associadas à parede Fructosyl transferase (Ftf) Produção de polímeros de fructose apartir da sacarose (fructanos – reservas extracelulares de glicose) Fructanase Hidrólise dos fructanos. Aumenta e preserva a acidificação Dextranase Hidrólise de glucanos Polissacarideos intracelulares Polímero intracelular de glicose Intracelular Fosfoenolpiruvato:fosfotransferase (PTS) Cataliza internalização de vários açucares em baixas concentrações extracelulares Membrana/citoplasma ATPases (F1F0 ATPase ou H+ATPase) Complexo enzimático que bombeia H+ para fora da célula. Importância? F0 membranar F1 citoplasmático Tolerância ao ácido Vantagem competitiva em pH baixo Global e multifactorial 20-11-2013 T 23-24 MJC

Biofilme e controlo do QS Os CSP T 23-24 MJC 20-11-2013

Factores envolvidos T 23-24 MJC 20-11-2013

Factores envolvidos T 23-24 MJC 20-11-2013

Mais factores T 23-24 MJC 20-11-2013

Fluor na prevenção da cárie T 23-24 MJC 20-11-2013

Prevenção da carie T 23-24 MJC 20-11-2013

Estudo das caries – Modelos animais Rat (ratazana) Tamanho Desenvolvem cárie segundo dieta (4 semanas) Modelos gnotobióticos e pathogen free 16-21 dias todos os molares  infecção MI Alterações do esmalte Cães, gatos, cavalos, porcos. Primatas. 20-11-2013 T 23-24 MJC

Técnicas de BM usadas Clonagem de genes / Sequenciação Mutações no cromossoma de S.mutans. Em que genes? Produção de potenciais proteínas de puras para estudos bioquímicos. Quais? Expressão de genes de virulência. Expressão de genes em heterólogos. Utilização de bactérias com moléculas repórter para a expressão de determinados genes. T 23-24 MJC 20-11-2013

1. Clonagem de genes Genes codificantes de proteínas extracelulares envolvidas na formação de polímeros de açucar. O que se sabia? Gtf e Ftf  glucosiltransferase e fructosiltransferase O que não se sabia? Como eram regulados? Quantos genes existiam? Como é que as proteínas contribuiam para a virulência? T 23-24 MJC 20-11-2013

1. Clonagem de genes Quantos genes existiam? Existem 3 genes gtf diferentes em cada estirpe Existe 1 gene ftf T 23-24 MJC 20-11-2013

2. Mutação dos genes de S. mutans Como é que as proteínas contribuem para a virulência? Fazendo mutação dirigida Com os genes gtf e ftf mutados a capacidade de provocar patologia é bastante diminuida. T 23-24 MJC 20-11-2013

3. Produção de potenciais proteínas de puras para estudos bioquímicos Cada uma das enzimas têm domínios conservados Há dois domínios Um enzimático para a síntese do glucano Um de reconhecimento e ligação ao glucano (específico de mutans) T 23-24 MJC 20-11-2013

4. Expressão de genes de virulência Quando são os genes gtf activados? Quando há baixo pH T 23-24 MJC 20-11-2013

Outras questões além de gtf Síntese de polisacarídeos intracelulares de armazenamento Internalização dos vários açucares Proteínas de superfícies (AgI/II) Biofilmes T 23-24 MJC 20-11-2013

Caracterização das respostas ao stress Identificação dos genes Criação de mutantes Criar quimeras genéticas para observar o efeito das mutações. Para quê saber as respostas ao stress? T 23-24 MJC 20-11-2013

Respostas ao pH + 100 proteínas diferentes são expressas a pH 5.0 61 são bombas de protões ATPase Algumas são enzimas para produzir amónia intracelularmente. Como pode ser amonia produzida intracelularmente? Produção de S.mutans com urease do S.salivarius T 23-24 MJC 20-11-2013

PCR “Isolamento” de genes de função desconhecida. Cerca de 1/3 do genoma de S. mutans codifica proteínas de função desconhecida. Estudos de expressão por microarrays. T 23-24 MJC 20-11-2013

Microarrays Não servem para estudar proteínas cujo controlo é feito pós transcrição. Qual é a solução? T 23-24 MJC 20-11-2013

Vacinas contra cáries Produção sistémica de anticorpos  memória S.mutans (superfícies sólidas) sIgA Resposta de curta duração Reforços Especificidade Etiologia Factores de virulência Adesão Formas de vacinação T 23-24 MJC 20-11-2013

Antigénios e modos de imunização Comprimidos de S. mutans inactivado Proteínas secretadas ou expressas por S.mutans Gtfs, Gbps, ag (I/II) e SpaP Disponibilização dos antigénio o máximo de tempo Tecido linfóide na associação da mucosa nasal e oral Peyer’s patches intestino Moléculas inteiras combinadas com partículas de alumínio, incluídas em esferas de poli-L-lactose. Actualmente partes das moléculas: Mais eficazes Mais fáceis de recombinar (junção da parte antigénica com toxinas aumenta longevidade da resposta) T 23-24 MJC 20-11-2013

Antigénios e modos de imunização Bactérias vivas (Salmonella enterica) Recombinante c/ agI/II + subunidade beta da toxina da colera. Administrado na mucosa nasal e no intestino T 23-24 MJC 20-11-2013

Segurança das vacinas Ensaios em humanos Soro de ratos imunizados com Strep. mutans reagia com tecido cardíaco. O material a ser utilizado como imunogénico tem de estar livre de material que possa ser prejudicial ao hospedeiro. T 23-24 MJC 20-11-2013

Resumo das estratégias de imunização T 23-24 MJC 20-11-2013

Novas perspectivas Cárie tem etiologia microbiana mas... Polimicrobiana Há outros factores... Relação com o pH (bem estabelecida) mas poucas terapêuticas exploram este factor. Remineralização diminuída Conhecem-se alguns dos mecanismos associados à recuperação da dentina. Concentração dos iões necessários à reminenalização Terapêuticas inovadoras com Células estaminais Substituição de microrganismos não acidogénicos no biofilme oral T 23-24 MJC 20-11-2013

Bibliografia Capítulo 11 Capítulo 16-19 Capítulo 32 T 23-24 MJC 20-11-2013