RNAs não codificadores Definição, funções e identificação através da bioinformática Gabriel Zaniboni

RNAs Não Codificadores Molécula de RNA funcional, ou seja, não precisa ser traduzida em proteína para que a informação contida em sua sequência exerça sua função; Produtos de genes de RNA;

RNAs Não Codificadores RNA ribossômico (rRNA) – principal componente (60 %) dos ribossomos: 3 rRNAs em procariotos (5 S, 16 S e 23 S), 4 rRNAs em eucariotos (5 S, 5.8 S, 18 S, 28 S); Left: The rRNA of the 30S ribosomal subunit, as determined at the Structural Biology Center. The parts of the rRNA as shown here are: messenger RNA (purple), head (green), central domain ((blue), and body (red) with H44 in cyan. The gold ribbons represent the binding from the anticodon stem loop. (Courtesy of the Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, UK)

RNAs Não Codificadores RNA transportador (tRNA) – molécula adaptadora que atua como elo entre a sequência de nucleotídeos do mRNA e a sequência de aminoácidos das proteínas; X-ray structure of a tRNA molecule found in yeast.

RNAs Não Codificadores Pequeno RNA nucleolar (snoRNA) – pequenas moléculas responsáveis por guiar modificações em outros RNAs durante a maturação destes (rRNAs, tRNAs, snRNAs): C/D box snoRNAs: associados com metilação, H/ACA box snoRNAs: associados com pseudouridilação; snoRNA structure. The structure of a H/ACA snoRNA (left) and a C/D box snoRNA (right). The targets for RNA modification are shown in blue. The most important snoRNA-associated proteins are listed below.

RNAs Não Codificadores Pequeno RNA nuclear (snRNA) – presente no núcleo de eucariotos, envolvidos em vários processos, como: Splice de RNAs, Regulação de fatores de transcrição e da RNA polimerase II, Manutenação dos telômeros;

RNAs Não Codificadores Micro RNA (miRNA) – atua na regulação da expressão gênica de eucariotos superiores, um único microRNA pode ter centenas de alvos diferentes: Mecanismo de complementaridade parcial com mRNAs, geralmente na região 3’ UTR, Atua diminuindo a expressão de seus alvos;

RNAs longos não codificadores Projetos de sequenciamento genômico evidenciaram que o número de genes codificadores de proteínas não muda significativamente entre os vertebrados, nem mesmo os metazoa; O que explica a diferença na complexidade biológica entre esses organismos? C. elegans (~1.000 células) e humanos (~ 100 trilhões de células) possuem aproximadamente o mesmo número de genes.

RNAs longos não codificadores Sabe-se hoje em dia que a maior parte do genoma dos metazoários é transcrita; Porção do transcriptoma que não é codificadora chega a ser até 4 vezes maior que a porção codificadora; Maior parte do genoma, que não codifica proteínas, parece estar envolvido na regulação da expressão gênica durante o desenvolvimento e a diferenciação dos organismos mais complexos; Classificação baseada em um cut-off realizado durante a purificação de RNA que exclui RNAs pequenos.

RNAs longos não codificadores Arbitrariamente considerados como sendo transcritos mais longos do que 200 nucleotídeos; lncRNAs se sobrepõem com ou intercalam-se entre outros transcritos codificadores ou não-codificadores; Classificação baseada em um cut-off realizado durante a purificação de RNA que exclui RNAs pequenos.

RNAs longos não codificadores Descritos pela primeira vez durante o sequenciamento em larga escala de bibliotecas de cDNA de camundongo (2002); Dado sua abundância, imaginou-se inicialmente que os lncRNAs eram apenas ruído transcricional; Classificação baseada em um cut-off realizado durante a purificação de RNA que exclui RNAs pequenos.

RNAs longos não codificadores A expressão de muitos lncRNAs é restrita a determinadas fases de desenvolvimento; Grande parte dos lncRNAs de camundongo são expressos especificamente durante a diferenciação celular de células-tronco embrionárias e no cérebro;

RNAs longos não codificadores A baixa conservação das sequências dos lncRNAs levou à afirmação de que esses transcritos não são funcionais; A ligação de fatores de transcrição a loci não codificadores e a evidência de seleção purificadora atuando em promotores de lncRNAs sugerem que esse tipo de expressão é regulada; In natural selection, negative selection[1] or purifying selection is the selective removal of alleles that are deleterious.

RNAs longos não codificadores Porém: Na realidade, vários lncRNAs conhecidos detêm um grau de conservação, sendo a função de vários deles conhecida; lncRNAs podem exibir trechos de sequências conservadas mais curtas do que aquelas presentes em transcritos codificadores de proteínas (Xist); A ausência de conservação pode ser indício de altas taxas de evolução das sequências primárias dos lncRNAs, caso essas sequências apresentem maior plasticidade em relação à sua estrutura/função (HAR1); HAR1, a ncRNA expressed in Cajal-Retzius neurons in the developing neocortex.

RNAs longos não codificadores A pouca conservação dos lncRNAs pode indicar que o processo da transcrição, ao invés do produto, é que é funcional (como por exemplo, a abertura de longos trechos de cromatina expõe sítios de ativação transcricional e propicia a atuação da RNA polimerase); Demais evidências (conservação de estrutura secundária, padrões de splice e localização subcelular) sugerem funções além da remodelação transcricional;

Funções As funções dos lncRNAs não podem ser inferidas sempre com base na sua sequência ou estrutura; Atuam regulando a expressão gênica em processos de dinâmica cromossomal, biologia de telômeros e organização estrutural subcelular;

Modificação da Cromatina lncRNAs podem mediar alterações epigenéticas recrutando complexos remodeladores de cromatina em loci específicos; O ncRNA HOTAIR (Hox transcript antisense RNA) se origina no locus HOXC e silencia a transcrição através de 40 kb do locus HOXD (efeito trans);

Modificação da Cromatina O ncRNA HOTAIR seria responsável pelo recrutamento do complexo de remodelamento de cromatina PRC2, que atua através de metilação do DNA;

Regulação Transcricional Transcrição de acentuadores e promotores leva à formação de ncRNAs; Promotores proximais podem ser transcritos e recrutar proteínas que se ligam a RNA, integrando suas funções na maquinaria transcricional;

Regulação Transcricional Danos no DNA induzem a transcrição do promotor da ciclina D1 (ciclo celular), que recruta a proteína TLS, um inibidor da CBP e p300, silenciando a expressão da ciclina D1;

Regulação Transcricional lncRNAs também podem atuar como cofatores na modulação da atividade de fatores de transcrição;

Regulação Transcricional O lncRNA Evf2 é transcrito a partir de um acentuador, recrutando o fator de transcrição DLX2 para induzir a expressão de genes codificadores de proteínas adjacentes;

Regulação Transcricional lncRNAs podem atuar regulando a atividade da RNA polimerase II;

Regulação Transcricional Um transcrito formado em uma região upstream do locus DHFR forma um triplex na região promotora e impede a ligação do cofator TFIID;

Regulação Pós-Transcricional A capacidade dos lncRNAs de reconhecer sequências complementares permite interações específicas durante o processamento de mRNAs, como splice, edição, transporte, tradução e degradação; O lncRNA antisenso Zeb2 complementa o sítio de splice 5’ UTR do “dedo de zinco” (zinc finger) Hox mRNA Zeb2, prevenindo o splice de um intron necessário à tradução desse mRNA;

Regulação Pós-Transcricional

Regulação Pós-Transcricional A ligação de ncRNAs a mRNAs, ou mesmo a ocorrência de ncRNAs que possuem longos grampos, pode levar à formação de pequenos RNAs de interferência (siRNAs) endógenos e ao silenciamento da expressão gênica; Essas são as funções conhecidas, mas acredita-se que existam vários outros mecanismos a serem descobertos;

Significância Médica Potencial envolvimento dos lncRNAs em doenças que tenham relacionamento com processos de diferenciação e desenvolvimento, principalmente o câncer; ncRNA antisenso transcrito a partir do locus p15 (supressor de tumor) tem perfil de expressão alterado em leucemia; Trabalhos do lab com câncer pancreático e renal.

Identificação de lncRNAs A detecção de genes de RNAs não codificadores em sequências genômicas é um problema ainda não resolvido na bioinformática; Principais abordagens: Análise composicional, predição de estrutura secundária, homologia estrutural ou de sequências, sinais de promotores e terminadores;

Identificação de lncRNAs Duas ferramentas, QRNA e RNAz, combinam predição de estrutura secundária e análise de homologia entre sequências; O algoritmo Dynalign realiza um alinhamento de estrutura secundária entre duas sequências de RNA; Para maior precisão, algumas ferramentas limitam o escopo da análise a famílias de ncRNAs específicas, como tRNA, miRNA e snoRNA;

Identificação de lncRNAs Entretetanto, nenhuma ferramenta de detecção de ncRNAs gerais, disponíveis hoje em dia, é comparável em confiança aos softwares de detecção de genes codificadores de proteínas; Como os diversos métodos disponíveis para a detecção de ncRNAs são complementares, uma abordagem prática consiste na combinação deles; In contrast to ncRNA genes, protein genes exhibit codon-bias, open reading frames and strong sequence conservation, simplifying their detection.

Identificação de lncRNAs Moses (modular sequence suite): combina o resultado de diversos métodos diferentes para encontrar regiões no genoma que contenham candidatos a serem ncRNAs; Inclui: BLAST, RNAz, Dynalign, RNAfold.