Técnicas de Imunologia Citometria de Fluxo Slides adaptados de uma colecção amavelmente cedida por Alexandre Salvador (BioAtlântico) Prof.Doutor José Cabeda

O que é um Citometro de Fluxo? Prof. Doutor José Cabeda

O que é um Citómetro de Fluxo? É um aparelho que permite analisar vários parâmetros (celulares?) Capta e digitaliza a dispersão de fotões, provocada pela passagem de partículas em suspensão alinhadas uma a uma, num fluxo laminar, frente a um feixe de luz. Prof. Doutor José Cabeda

Componentes Básicos de um Citómetro de Fluxo Suspensão de partículas Fluxo laminar Fluídos Óptica Fonte de iluminação Captação da dispersão da luz e da fluorescência Filtração da dispersão e da fluorescência Electrónica Conversão do sinal em valores analógico-digitais Aquisição, Processamento, Análise e Armazenamento por computador Prof. Doutor José Cabeda

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Exemplos do que podemos analisar por Citometria de Fluxo: Complexidade Antigénios celulares Tamanho Metabolismos Enzimas Receptores ADN Citoquinas Prof. Doutor José Cabeda

Propriedades de FSC e SSC Laser Prof. Doutor José Cabeda

Óptica - Canal de Dispersão Frontal ( tamanho- FS ) Sensor de FS Laser Prof. Doutor José Cabeda

Óptica - Canal de Dispersão Lateral ( complexidade- SS ) Laser Sensor de FS Sensor SS 900 Prof. Doutor José Cabeda

Óptica - Dispersão da Fluorescência Laser Sensor de FS Detectores de Fluorescência (PMT1, PMT4 etc.) Prof. Doutor José Cabeda

Óptica - Propriedade dos Filtros Filtro ou Espelho Dicróico Colocado a 45o Fonte de Luz Luz Transmitida Luz Reflectida Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda BD Prof. Doutor José Cabeda

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O que pode então dizer um Citometro de fluxo de uma célula? Tamanho (FSC) Complexidade (SSC) Fluorescência relativa. (FL1, FL2, FL3, FL4,...) Prof. Doutor José Cabeda

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Prof. Doutor José Cabeda O que é a Fluorescência? Laser Prof. Doutor José Cabeda

Intensidade de Fluorescência Emitted Fluorescence Intensity Binding Sites FITC Intensidade de Fluorescência Numero de eventos Prof. Doutor José Cabeda

Currently Available Fluorochromes (Visible Light Emission) Fluorochrome Laser (nm) Emission (nm) FITC 488 525 Cy3 488 565 R-PE (PE) 488 575 PE-Texas Red (PE-TR) 488 615 Pe-Cy5 (TC1) 488 667 PerCP (BD2) 488 675 PerCP/Cy5.5 (BD) 488 695 PE-Cy7 488 767 Texas Red 595 615 APC 633, 635 660 Cy5 633, 635 667 APC-Cy7 633, 635 767 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Espectros de Emissão PerCP Wavelength (nm) 400 450 500 550 600 650 700 1000 800 200 RPE APC FITC PI Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Pulso electrónico Laser Time Voltage Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Tipos de diagramas 1 parâmetro Histograma 2 parâmetros Dot Plot Contour plot Density plot Prof. Doutor José Cabeda

As Regiões ou Portas electrónicas Histograma Dot plot Prof. Doutor José Cabeda

TRANSFERENCIA DE ENERGIA POR RESSONÂNCIA Transferencia no radiativa de energía ES Energía Fluorescencia What is a tandem dye? A tandem dye is composed of two covalently conjugated fluorochromes with overlapping spectral characteristics. These characteristics allow the transfer of energy from one molecule to the other resulting in fluorescence emission at a longer wavelength. One molecule functions as the “donor” molecule, the other is the “acceptor” molecule. Current tandem dyes all use PE as the donor molecule. The schematic diagram demonstrates how energy is transferred from the donor molecule to the acceptor molecule. Energy applied to the dye in the form of light excites the donor molecule. The electrons move from the ground state to the excited state. Energy is released in the form of fluorescence when the electrons return to the ground state. When the excited states of the donor and acceptor molecule overlap, the released energy from the donor molecule is transferred to the acceptor molecule instead of returning to the ground state as fluorescence of the donor molecule. The electrons of the acceptor molecule then return to the ground state emitting fluorescence at the acceptor molecule wavelength. The more efficient the transfer, the less donor molecule fluorescence is observed. Molécula Donadora PE GS Molécula Receptora Texas Red/Cy5/Cy7 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda 1 LASER (488nm) 3 COLORES Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda 1 LASER (488nm) 4 COLORES Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda 1 LASER (488nm) 5 COLORES Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Cytomics™ FC500 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Cytomics™ FC500 OPTICA: 2 lasers colineares: 488 nm 633 nm Detectores: FS con dos ángulos de captura (1-8°, 1-19°) Side Scatter 5 PMT sensibles al rojo (de 185 a 900 nm) Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Cytomics™ FC500 OPTICA: 488DLP 500LP 600DLP 550DLP 525BP 620DSP 620SP 710DLP 755LP 675BP FL1 FL2 FL5 FL4 FL3 Detailed Filter Specs Side Scatter Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda COMPENSATION Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda 500 600 700 800 Wavelength nm Intensity FITC PE ECD PC5 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda FITC PE ECD PC5 500 600 700 800 Intensity FL1 525 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda FITC PE ECD PC5 500 600 700 800 Intensity FL1 525 FL2 575 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda FITC PE ECD PC5 500 600 700 800 Intensity FL1 525 FL2 575 FL3 620 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda FITC PE ECD PC5 500 600 700 800 Intensity FL1 525 FL2 575 FL3 620 FL4 675 Prof. Doutor José Cabeda

FITC Prof. Doutor José Cabeda 500 600 700 Nominal Measured Signal FL1 100 12 1 <0.1 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda FITC PE ECD PC5 FL1 FITC+ FL2 PE+ FL3 ECD+ FL4 PC5+ Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda FITC PE ECD PC5 FL1 FL2 FL3 FL4 ???? Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda FITC PE ECD PC5 FL1 FL2 FL3 FL4 85.5% 10.5% 3.1% 0.9% 0.7% 67.8% 25.0% 6.5% 0.3% 8.4% 66.7% 24.6% 0.2% 4.2% 2.3% 93.3% Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda FITC PE ECD PC5 FL1 FL2 FL3 FL4 100% 1.1% 0.4% 0.2% 12.3% 12.7% 4.5% 3.6% 36.8% 2.4% 1.0% 9.5% 36.9% Prof. Doutor José Cabeda

Uncompensated vs Compensated FL2 In A, the amount of fluorescence emission detected by the PE detector and the amount of PE fluorescence detected by the FITC detector is shown. After compensation, B, the particles show only their appropriate fluorescence emission. FL1 Prof. Doutor José Cabeda

COMPENSATION IS INTENSITY DEPENDENT partially compensated FL2 It is an absolute requirement that particles used for compensation be at least as bright as the antibody staining. If this condition is not met, antibodies whose fluorescence is brighter than the particles used for compensation will not be properly compensated. FL1 fully compensated uncompensated partially compensated Prof. Doutor José Cabeda

COMPENSATE INSTRUMENT USING STAINED CELLS 1. Adjust PMT voltages using unstained cells 2. Adjust compensation for each fluorochrome We recommend instrument compensation using stained cells because appropriate particles are not currently available for the fluorochromes that are available. Prof. Doutor José Cabeda