Immunologia Teoria Clonal Características dos Epitopes T e B Linfócitos B, Linfócitos T Imunoglobulinas Recombinação somática 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Os Linfócitos T e B Características dos Epitopes T e B A teoria clonal Linfócitos B Imunoglobulinas Os linfócitos B na resposta Imunológica Linfócitos T Subtipos de Linfócitos T 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Propriedades dos epitopes B As características dos epitopes B são determinadas pela conformação do epitope e do anticorpo Modelo da chave fechadura Tamanho limitado pelo tamanho do anticorpo Dois modelos O epitope encaixa num “bolso” do anticorpo Carbohidratos, oligonucleótidos, haptenos O epitope consiste numa superfície externa de uma estrutura mais complexa, a qual é complementar da do anticorpo Proteínas globulares O epitope é sempre uma zona externa e acessível Numa proteína o epitope pode conter a.a. não sequenciais Os epitopes B tendem a consistir em regiões flexíveis dos imunogénios Proteínas complexas têm múltiplos epitopes B, alguns dos quais são imunodominantes 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Propriedades dos epitopes T Se a imunização for feita com epitopes nativos A memória B é restrita a epitopes nativos A memória T inclui epitopes nativos e desnaturados As células T não reconhecem antigénios solúveis nativos, mas antigénios processados pelas APC e apresentados pelo MHC Péptidos antigénicos para as células T formam um complexo tripartido: MHC-Antigénio-TCR Os Antigénios têm que ter: zonas de afinidade ao MHC (a agregotope) Baixa selectividade (muitos péptidos ligam-se ao mesmo MHC) zonas de afinidade ao TCR( o epitope) Alta selectividade Os epitopes T são sempre sequenciais Os epitopes T são frequentemente internos na molécula Os epitopes dominantes são determinados em parte pelo MHC 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Os Linfócitos T e B Características dos Epitopes T e B A teoria clonal Linfócitos B Imunoglobulinas Os linfócitos B na resposta Imunológica Linfócitos T Subtipos de Linfócitos T 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda A teoria clonal (I) 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda A teoria clonal (II) 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda A teoria clonal (III) 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Selecção clonal induz proliferação e aumenta a frequencia das células efectoras No. of cell divisions No. of cells with useful specificity Threshold of protective effector function 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Clonal nature of adaptive immune response allows for removal of harmful cells Opportunity to remove harmful specificity at an early stage of development IMMUNOLOGICAL TOLERANCE !!!!Cells specific for self antigen!!!! Antigen receptors recognising self antigens can be individually purged from the antigen receptor REPERTOIRE before clonal expansion 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Os Linfócitos T e B Características dos Epitopes T e B A teoria clonal Linfócitos B Imunoglobulinas Os linfócitos B na resposta Imunológica Linfócitos T Subtipos de Linfócitos T 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Estrutura das Imunoglobulinas (I) Uma zona constante que determina a função efectora Uma zona variável que determina a especificidade 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Estrutura das Imunoglobulinas (II) Cada zona é formada por 2 cadeias polipeptidicas unidas por pontes disulfureto: Cadeia Leve (L) K ou l Cadeia Pesada (H) m,g,a,d ou e 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Estrutura das Imunoglobulinas (III) Cada cadeia é formada por domínios: Cadeia H VH, CH1, CH2, CH3 Cadeia L V, CL 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Estrutura das Imunoglobulinas (IV) Decomposição química das Ig Fc Fab F(ab’)2 Cadeias L e H 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Classes das Imunoglobulinas (I) A classe das imunoglobulinas é determinada pelo isotipo da respectiva cadeia pesada 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Classes das Imunoglobulinas (II) 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Domínios das imunoglobulinas Cadeias b Estabilizadas por S-S Domínios hipervariáveis nas zonas de ligação das cadeias b 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

O domínio da região variável Regiões hipervariáveis (HV) Formam a zona de ligação ao antigénio (Complementary Determining Region) Situam-se nos “loops” entre as cadeias b Flexíveis => modificações conformacionais após a ligação ao antigénio Regiões Framework (FR) 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

O domínio das regiões constantes CL e CH1 Extendem os braços Fab, aumentando sua rotação máxima Mantêm juntos o VH e VL (S-S) Aumenta o número de combinações VH/VL possíveis, estabilizando-as “Hinge” Region Cadeias a, d e g Rica em resíduos de prolina Flexível Faz com que os braços fab assumam angulos variáveis, quando ligados ao antigénio 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

O domínio das regiões constantes IgA, IgD, IgG CH1, Hinge, CH2, CH3 IgE, IgM CH1, CH2, CH3, CH4 Função desconhecida Forma sIg e mIg Terminal COH Cel. Pré B -> mIgM Resting -> mIgM ou mIgD Memoria -> qualquer Cadeia paralela oligosacaridica Mais acessível ao meio Activação do complemento (IgG,IgM) 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda Função desconhecida

Prof. Doutor José Cabeda Propriedades das Ig 10-15% da Ig sérica Ig predominante nas secreções (leite, saliva, lágrimas, muco boncrial, do tracto genitourinário e digestivo) 80% da Ig sérica IgG1,IgG3,IgG4 atravessam a placenta IgG3 é o + eficiente activador do complemento IgG4 não activa o complemento IgG1 e IgG3 ligam-se com alta afinidade ao receptor Fc, mediando a opsonização 0.2% Ig sérica mIGD sIgD função? Mediador da hipersensibilidade 5-10% Ig sérica 1ª Ig produzida na resp. Imune 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Os Linfócitos T e B Características dos Epitopes T e B A teoria clonal Linfócitos B Imunoglobulinas Os linfócitos B na resposta Imunológica Linfócitos T Subtipos de Linfócitos T 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

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Immune effector mechanisms against extracellular pathogens & toxins NEUTRALISATION Y ` Y ` Y ` Y ` Adhesion to host cells blocked Prevents invasion Toxin release blocked Prevents toxicity NEUTRALISING ANTIBODIES 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Effector mechanisms against extracellular pathogens OPSONISATION Bacteria in extracellular space Ab + Fc receptor Phagocytosis OPSONISATION binding 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Effector mechanisms against extracellular pathogens COMPLEMENT Bacteria in plasma Lysis binding Ab & COMPLEMENT + Phagocytosis Complement & Fc receptor Opsonisation 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Os Linfócitos T e B Características dos Epitopes T e B A teoria clonal Linfócitos B Imunoglobulinas Os linfócitos B na resposta Imunológica Linfócitos T Subtipos de Linfócitos T 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Timo: Amadurecimento de Linf.T Células progenitoras entram e localizam-se no córtex do timo Dividem, e amadurecem, ao longo de 3 semanas Rearranjam os genes TCR gd ab Sofrem selecção pos./neg. 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

A selecção timica do repertório Rearranjos aleatórios originam especificidades aleatórias 1015 ab e 1018 gd Só alguns rearranjos são úteis Alguns são auto-reactivos Alguns não reconhecem o MHC próprio Alguns não são funcionais Os timócitos sofrem 2 tipos de selecção Positiva (As células que reconhecem o MHC próprio) Negativa Rearranjos não funcionais Alguns rearranjos auto-reactivos 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

A Activação das células T Complexas vias de transdução de sinal Vários receptores envolvidos Estimulação via TCR sem co-estimulação induz anergia 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Superantigénios Proliferação policlonal Delecção policlonal 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Os Linfócitos T e B Características dos Epitopes T e B A teoria clonal Linfócitos B Imunoglobulinas Os linfócitos B na resposta Imunológica Linfócitos T Subtipos de Linfócitos T 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Subtipos de Linfócitos T Células Efectoras Th Th1(secretam IL2, IFN-g, TNF-b; promovem a inflamação e hipersensibilidade e estimulam linfócitos Tc) Th2 (secretam IL4, IL5, IL6, IL10; estimulam a resposta B) Tc Linf. T Memória (fenotipicamente semelhantes às células efectoras) ab (a maioria em circulação) gd (proporção significativa no intestino; combate aos tumores?) 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Th Th Effector mechanisms against intracellular bacteria MACROPHAGE ACTIVATION Inflammatory T cell Th Cytokines Th Activation of killing mechanisms Activated macrophage Resting Macrophage 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Effector mechanisms against intracellular pathogens CYTOXICITY CTL CTL CTL Target cell death Viral infection Lethal hit 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

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Immunologia Curso de Análises Clinicas Aula Teórica Nº 5 Recombinação V(D)J: Os genes das Ig e TCR 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda A teoria clonal centra-se na existência de receptores do antigénio clonotípicos : Linf. B : mIg Linf. T: TCR 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Similaridades e diferenças entre o TCR e as Ig 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

A codificação genética do TCR e Ig NECESSIDADE BIOLÓGICA: Criar um número ilimitado de TCR LIMITAÇÃO PRÁTICA: O Genoma é limitado, pelo que pode codificar um número limitado de Proteínas RESPOSTA BIOLÓGICA: O mecanismo de recombinação somática cria uma diversidade ilimitada a partir de um número limitado de elementos genéticos base 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Os receptores do antigénio são codificados por mais que um gene Cadeias Pesadas: IgH Cadeias Leves: Igl e Igk TCR Cadeia a Cadeia b Cadeia g Cadeia d 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Os genes das Imunoglobulinas Cromossoma 16 Cromossoma 6 Cromossoma 12 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Os genes do TCR 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Os genes do TCR são diferentes em células diferenciadas e células indiferenciadas 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda O rearranjo somático 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Regulação da recombinação: as sequências sinal 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Regulação da recombinação A recombinação somática segue a regra: “ só rearranjam elementos com espaçadores de comprimentos diferentes”. 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Equação de recombinação 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Tipos de recombinação 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

As junções dos elementos V-D-J não são pré-definidas Delecção de nucleótidos de cada elemento Adição de novos nucleótidos Nucleótidos P (origem numa estrutura palindrómica) Nucleótidos N (adicionados aleatoriamente pela enzima TdT) número potencial de 1016 ab-TCR e 1018 gd-TCR 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

A origem dos nucleótidos P 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

A origem dos Nucleótidos N 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Leitura dos segmentos Db faz-se em 3 ordens de leitura 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Diversidade combinatorial 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Locais de diversidade de junção: os CDR 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Os CDR na estrutura proteica 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

A recombinação origina novos genes e novos clones Cada gene obtido é potencialmente diferente dos restantes Os genes do TCR de cada linfócito são diferentes dos de qualquer outra célula não linfóide A recombinação V(D)J ocorre precocemente na ontogenia das células determina a sua maturação na linhagem T cada célula origina um clone de células T 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Estimativas da diversidade 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Mutação somática dos genes das Ig Ocorre no centros germinais dos nódulos linfáticos Ocorre de forma aleatória A selecção dirigida pelo antigénio causa predominância de mutações nos CDR Resulta num aumento da afinidade dos anticorpos 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

O TCR não sofre mutação somática 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

O Gene TCR g no locus TCR a 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Aplicações no laboratório de análises clínicas 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Necessidades Funcionais do TCR Reconhecer o péptido Reconhecer o HLA do indivíduo como tal Reconhecer HLAs estranhos como tal Estar ancorado na membrana enviar sinais para o interior da célula após o reconhecimento do HLA/HLA+péptido 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Estrutura do TCR (I) Heterodimero cujos polipéptidos se encontram unidos por ligações dissulfídricas 2 formas diferentes, expressas em células diferentes heterodimero ab (a maioria dos linfócitos T circulantes) heterodimero gd (5-10% dos linfócitos T circulantes) Ambos os heterodimeros são proteínas constitucionais da membrana citoplasmática Ambos os heterodimeros se associam a um complexo proteico denominado CD3 A maioria encontra-se no exterior da célula, possuindo ainda uma zona transmembranar, e uma muito curta cauda citoplasmática 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Estrutura do TCR (II) 2 Existem 4 regiões de hipervaria-bilidade na sequência dos a.a. : 3 zonas análogas às observadas nas imunoglobulinas, sendo por isso referidas com nomes análogos (CDR1 a CDR3 - complementary determining region). 1 zona denominada HV4 (Hypervariable region 4) O CDR1, CDR2 e HV4 são codificados pelos “genes” V O CDR3 é codificado pela junção V(D)J 1 3 3 4 2 4 1 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda 2 1 3 3 4 1 2 4 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Descobrindo especificidades de ligação Mutações no péptido seleccionam mutações complementares no CDR3 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Mutações nos resíduos das -hélices do HLA não induzem selecção nas V utilizadas: A mesma mutação tem efeito diverso, dependendo do péptido Sem efeito 20-102 X I I I 20- 102 X MCC(99K) MCC(99E) 102-103 X I >103 Sem estimulação 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Mutações nos resíduos das -hélices do HLA não induzem selecção nas V utilizadas: TCR diferentes são diferentemente afectados pelas mesmas mutações Sem efeito 20-102 X I 20- 102 X 102-103 X I >103 Sem estimulação 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Mutações nos resíduos das -hélices do HLA não induzem selecção nas V utilizadas: Não se observou nenhum padrão de comportamento do tipo mut. X-hélice - mut. CDR 1/CDR 2 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda O CDR 3 é a principal força que governa a especificidade, sendo o HLA reconhecido como parte do todo, e não separadamente NOTA: verificar no diagrama que efectivamente o CDR 3 é a zona do TCR que mais contacta o péptido / HLA 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda O H4 está particularmente envolvido nas ligações tipo super antigénio. 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda

Factores que influenciam a diversidade do TCR Tolerancia Rearranjos constructivos Selecção negativa Selecção Positiva Estrutura do péptido péptidos c/ a.a. volumosos nos resíduos expostos originam repertórios mais diversos Concentração/densidade do ligando [] estimula apenas os TCR de maior afinidade Repertório de TCR limitado relatos contraditórios sobre a influencia de delecções de Vß na diversidade do repertório especifico Superantigénios Não especificos p/ péptido mas p/ Vß activação policlonal superantigénios endógenos originam delecção de expressão de Vß à periferia 2001/2002 Prof. Doutor José Cabeda