Preparo das amostras para espectrometria de massa Fabiane Maria Lima Sousa Mestranda PPGZ-UFC Orient.: Prof.: Arlindo Moura
A digestão é necessária para que todas as partes da proteína fiquem uniformemente expostas à dissociação e ionização, e para aumentar a eficiência desses processos. As bandas/spots protéicos correspondentes à proteína de interesse serão: Excisadas Descoradas Submetidas à digestão enzimática
Imagem gerada pelo PDQuest: Master gel
Proteases normalmente utilizadas: Quimotripsina Pepsina Carboxipeptidases Aminopeptidases Tripsina ou uma combinação delas Capacidade Previsibilidade Disponibilidade
Cuidados no procedimento Manter o gel umedecido com água destilada para evitar o ressecamento. Deve-se usar reagentes de boa qualidade e procedência conhecida. Durante os procedimentos de corte e digestão, é importante o uso de luvas, jaleco de mangas compridas, e, se possível, touca e máscara, para evitar contaminações, a principal é a queratina humana.
Etapas do procedimento Excisão ou corte dos spots Spot no gel, é cortado no centro e dividido em pedaços menores. Existem os métodos manuais (tesoura, bisturi ou gilete), e existe um método computadorizado (spot picker).
Excisão manual com bisturi
Método computadorizado (Spot picker)
Lavagem do gel Solução de acetonitrila/bicarbonato de amônio Desidratado o gel com acetonitrila Remover a acetonitrila e secar completamente os géis no Speed Vac.
Digestão com tripsina Solução de tripsina diluída será distribuída de forma a cobrir os pedaços de gel. Extração dos peptídeos (por meio de lavagens)com ácido fórmico 5% ou TFA 5%/ acetonitrila 50%. Concentrar as amostras .
Obrigada fmlsousa@gmail.com