Espectrofotometria Graduação em Biotecnologia Disciplina de Técnicas Instrumentais Prof. Fabricio Rochedo Conceição fabricio.rochedo@ufpel.edu.br fabriciorc@pop.com.br Espectrofotometria 11 de maio de 2012

Espectrofotometria visível e ultravioleta Método analítico baseado em medidas de absorção de radiação eletromagnética Permite identificar e quantificar compostos orgânicos e inorgânicos Região ultravioleta – 200 a 400 nm Região visível – 400 a 800 nm

Aplicações Esta técnica é muito usada em laboratórios de controle de qualidade (indústrias), pesquisa e de análises clínicas e toxicológicas Em biotecnologia: - Proteômica - Genômica - Transgenia - Expressão de proteínas recombinantes... *** Análise de proteínas, DNA e RNA

Absorção de Radiação Vários fenômenos podem ocorrer com a radiação luminosa, como: reflexão, refração, espalhamento ou absorção

Absorção de Radiação Os comprimentos de onda que uma certa substância absorverá são característicos da sua estrutura, diferindo de substância para substância. Exemplos: DNA e RNA = 260 nm Proteínas = 280 nm Células bacterianas = 600 nm Benzeno = 255 nm ...

Lei de Lambert-Beer Através dessa lei, intensidades da radiação incidente e emergente podem ser relacionadas com as concentrações do material presente na solução Efeitos de reflexão, refração e espalhamento não são considerados nessa lei. A radiação incidente deve ser monocromática

Lei de Lambert-Beer A = - log10 T T = I1 / I0 I0 = intensidade da luz incidente I1 = é a intensidade da luz uma vez tendo atravessado o meio l = é a distância que a luz atravessa A = - log10 T T = I1 / I0

Absorbância Transmitância É a capacidade do material em absorver radiações de comprimento de onda específico. 0 a 2 Transmitância É a intensidade de luz remanescente após passar por uma amostra de matéria. 0 a 100%

ENFIM, a lei de Lambert-Beer permite determinar a concentração de uma substância em função da absorção de luz

Espectrofotômetro É um instrumento que serve para medir a intensidade da luz em função de um comprimento de onda específico.

Diagrama de um espectrofotômetro

Fontes luminosas mais comuns Luz UV Lâmpada de gás hidrogênio ou deutério Mercúrio Luz Visível Tungstênio

Cubetas Espectrofotometria de Luz Visível Cubeta de Vidro ou Plástico Espectrofotometria de Luz Ultravioleta Cubeta de Quartzo

Dicas Localização do espectrofotômetro - Bancada estável e exclusiva (se possível) - Longe de fontes eletromagnéticas (rádio, microondas...) Ligar 30 mim antes do uso Cubetas (tipo e manuseio) Calibração

Obrigado!