Métodos para detecção de alérgenos em alimentos Gerlinde Teixeira Departamento de Imunobiologia Universidade Federal Fluminense

Antigenos vs Alérgenos Imunógeno Qualquer substância capaz de estimular linfócitos Proteinas, lipoproteinas, glicoproteinas, Hapteno Qualquer substância capaz de estimular linfócitos desde que acoplado a uma proteina Moléculas pequenas como os corantes

Antigenos vs Alérgenos Alergeno Qualquer substancia que leva a reações adversas sejam mediadas por Linfócitos B – produção de IgE ou IgG Linfócitos T – produção de citocinas de padrão Th1 - Inf, Il-1, Il-2, TNF Th2 - Il-4, Il-5, Il-6, Il-10,

Resposta a antígenos alimentares Tolerância oral Proteína alimentar Via oral  Anticorpos sistêmicos  Células B e T sistêmicas  Resposta local – Th3 Contexto fisiológico Contexto inflamatório Imunização sistêmica  Anticorpos sistêmicos  Células B e T sistêmicas  Resposta local – Th1 / Th2

Classificação dos Alérgenos alimentares Crustáceos Lagosta Camarão Siri Moluscos Mexilhões lulas Peixes Clara de ovo Leite Sementes Gergelim Girassol Sementes de algodão Mostarda Nozes Amendoim Morango Legumes Trigo

Reações adversas a alimentos Os sinais e sintomas consequentes a uma variedade de reações fisiopatologicas que podem ser mediadas por mecanismos Imunológicos Não imunológicos

Mecanismos envolvidos nas alergias alimentares Mediados por IgE Reações anafiláticas leves ao choque Mediadas por IgG e seus subtipos Diarreia Inflamação intestinal crônica Dermatite herpetiforme IgA Insuficiência renal

Estrutura da Imunoglobulina

As cinco classes de Ig O que determna a classe são as regiões FC a especificidade a região Fab É possivel ter uma especificidade com as 5 classes

As formas poliméricas IgA IgM

Propriedades das Ig’s humanas IgG IgA IgM IgD IgE Classe de cadeia H g a m d e Subclasse de cadeia H g1 a g4 a1, a2 Tipo de cadeia L k e l Fixação do complemento + ++++ Meia vida sérica (dias) 23 6 5 3 2 Transferência Placentária Lise bacteriana +++ ? Atividade anti-viral

Propriedades das IgG’s humanas Abundancia (% de IgG total) 70 20 06 04 Meia vida no soro 23 7 Passagem placentária +++ + Fixação de complemento - Ligação a Receptores FC

Idiotipo

Hipersensibilidade Tipo I Hipersensibilidade imediata mediada por IgE e IgG1

Mecanismo de ação Estimulo antigênico com proteínas heterólogas Ativação de Linfócitos Th2 produção de Il4, Il5, Il6 Mudança de isotipo para IgE Ocupação dos rFc de alta afinidade dos mastócitos

Ativação de Mastócitos Novo estimulo antigênico Ligação do antígeno à IgE Degranulação dos mastócitos Inflamação Patologia Humana, Robbins

Hipersensibilidade Tipo III Hipersensibilidade mediata mediada por imunocomplexos de IgG

Mecanismos de ação As lesões teciduais IgG ativa inúmeros mediadores séricos, em especial o sistema complemento Os complexos se formam predominantemente na circulação Lesão deposito nas paredes dos vasos sanguíneos da microcirculação principalmente em estruturas de filtragem, como o glomérulo renal, articulação, etc

Formação do imunocomplexo Só se formam na presença de antígenos com múltiplos epitopos (>2) Quando moléculas de antígenos solúveis e anticorpos estão presentes numa relação molar apropriada, podem unir-se umas às outras formando uma rede multimolecular.

Hipersensibilidade Tipo IV Hipersensibilidade tardia mediada por células

Mecanismos de ação Mediada por células, linfócitos T macrófagos ativados Citocinas Il 1, Il 2, TNF, INF

Dietas de exclusão Um dos princiapis tratamentos para as alergias alimentares Pode ter como consequencia as deficiencias alimentares Dificuldade para os cuidadores de pacientes alergicos Dificuldade de integração de algumas crianças às atividades sociais que envolvem a alimentação

Alérgenos Como a reação a alergenos é potencialmente severa se faz necessário regulamentações de seu controle. Rotulagem - alerta da presença dos principais alergenos principal meio de previnir como ocorre para o gluten

Métodos para detecção de antígenos alimentares Através de anticorpos Anticorpos de pacientes alergicos Produção de anticorpos policlonais Produção de anticorpos monoclonais Purificação de proteínas    - Precipitação Colunas de purificação

Análise de alimentos baseado em IgE humana Por colunas de afinidade Testes de ELISA Radio imunoensaio

Immunoblotting Reagentes utilizando anticorpos Mono-especificos Imunoblotting com antígenos

Produção de anticorpos policlonais Obtida a fração antigenica imunizar o animal com >100 mg de antígeno associado a um adjuvante dia o 14 21 28 Primária Secundária sangria Ag Ag + adjuvante

Produção de Ac monoclonais

Esquema da técnica do ELISA Cobertura da placa com cada fração Incubar com ptn não relacionada Lavar a placa 2x Lavar a placa 2x Incubação com soro imune Incubação Ac marcado com enzima Lavar a placa 6x Lavar a placa 6x interromper com H2SO4 Ler a 490nm Incubação com substrato cromógeno

Resultados Baixa reatividade no ELISA Razões para isto adesividade baixa das frações proteicas ao plástico baixa antigenicidade a diminuição de reação AgAC menos Ac marcado menor atividade ezimática menos cor

Ac anti X de outro animal ELISA DE CAPTURA Sensibilidade aumentada Permite a quantificação Ac anti X Ac anti X de outro animal Ptn inespecífica + Ag a ser testado Finalização da reação com Ac marcado

Imunoblot Preparar o extrato proteico Correr um gel de poliacrilamida Transferir para nitrocelulose Reação imunologica semelhante ao ELISA Leitura da absorbancia para determinação da intensidade de reação.

Polymerase chain reaction (PCR) Vantagem a alta afinidade Desvantagens Preço Determinação das sequencias de iniciação

Antígenos sequenciados Mais de 600 Espécie Nome vulgar Allergeno Número de aminoácidos