Teste de Endotoxinas bacterianas Controle de Qualidade Biológico e Microbiológico de Produtos Farmacêuticos e Cosméticos Teste de Endotoxinas bacterianas Prof. Fernando Henrique Andrade Nogueira

Teste de Endotoxinas bacterianas É considerado um método alternativo ao dos coelhos (USP XX – 1980) Mais rápido e mais sensível → endotoxina Teste in vitro – ausência da resposta fisiológica do animal ao pirogênio. Dúvidas quanto à deteção de pirogênio não oriundo de bactérias Gram (-)

Teste de Endotoxinas bacterianas O lisado do amebócito do caranguejo Limulus polyphemus coagula em contato com endotoxinas bacterianas O sangue do caranguejo é drenado e centrifugado Os amebócitos são separados e lisados com o uso de solução hipotônica ou métodos mecânicos O lisado é então estabilizado e liofilizado, sendo estável por 3 anos a 4 oC

Teste de Endotoxinas bacterianas Princípio da técnica: Reação enzimática entre o lisado (LAL) e a endotoxina resultando em coagulação Temperatura ótima – 37 a 39 oC pH ótimo – 6,0 a 7,0

Teste de Endotoxinas bacterianas Materiais: Todos os materiais devem ser apirogênicos (30 minutos a 250 oC ou equivalente) Água reagente para LAL: deve-se utilizar água estéril para injetáveis ou outra que não reaja com o LAL no limite de sensibilidade deste

Teste de Endotoxinas bacterianas Os reagentes são disponibilizados em kits Reagente LAL: padronizado para detectar 0,03; 0,06; 0,125 e 0,25 unidades de endotoxina (UE) por ml A quantidade de LAL utilizada é fixa (0,1 ml) Pode ser congelado a -4 oC e utilizado em até 4 semanas

Teste de Endotoxinas bacterianas Endotoxina bacteriana: reconstituir com 5 ml de água estéril e apirogênica e agitar em vórtex por 5 minutos. Guardar em 2 a 8 oC por até 4 semanas São preparadas diluições seriadas do padrão de endotoxina para a determinação da sensibilidade do lisado (LAL) e para comparação no teste propriamente dito.

Teste de Endotoxinas bacterianas Amostra: deve ter o pH ajustado para a faixa de 6,0 a 7,5; a menos que citado diferentemente na monografia Podem ser empregadas soluções apirogênicas e estéreis de NaOH ou HCl 0,1 M ou mais diluídas

Teste de Endotoxinas bacterianas Método semi-quantitativo Confirmação da sensibilidade do LAL (antes do teste) Sensibilidade do LAL: menor quantidade de endotoxina detectável pelo reagente Teste realizado em quadruplicata Controle negativo: água + LAL

Teste de Endotoxinas bacterianas Confirmação da sensibilidade do LAL (antes do teste) Diluições seriadas do padrão de endotoxina compreendendo 0,25; 0,5; 1 e 2 vezes a sensibilidade rotulada (λ) do lisado Sensibilidade rotulada do lisado (λ) = 0,12 UE/ml Concentrações de endotoxina: 0,03; 0,06; 0,12 e 0,24 UE/ml

Teste de Endotoxinas bacterianas Confirmação da sensibilidade do LAL (antes do teste) Incubar por 1 hora a 37 oC Reação positiva: gel firme mesmo quando invertido a 180º Reação negativa: não forma gel firme ou forma gel viscoso que não mantém a integridade quando invertido

Teste de Endotoxinas bacterianas Confirmação da sensibilidade do LAL (antes do teste) Ponto final – maior diluição da endotoxina que apresenta resultado positivo Sensibilidade do lisado = antilogaritmo da média dos 4 pontos finais convertidos em log Deve estar entre 0,5 e 2 vezes a sensibilidade rotulada do lisado (λ)

Teste de Endotoxinas bacterianas Confirmação da sensibilidade do LAL (antes do teste) Sensibilidade rotulada do lisado (λ) = 0,12 UE/ml 10-1,075 = 0,08 UE/ml; de acordo (0,06 – 0,24)

Teste de Endotoxinas bacterianas Teste propriamente dito A quantidade do reagente LAL é a mesma em todos os tubos (0,1 ml) A endotoxina é diluída em série geométrica que deve compreender a faixa de 0,5 a 2 λ A amostra é diluída em série até que o ponto final seja alcançado

Teste de Endotoxinas bacterianas Teste propriamente dito Soluções preparadas em duplicata (exceto o controle negativo) Agitar levemente os tubos e incubar a 37 oC por 1 hora. Os tubos não podem sofrer vibração Reação positiva, negativa e ponto final da mesma maneira que no teste de sensibilidade do lisado

Teste de Endotoxinas bacterianas Teste propriamente dito Controle negativo: água + LAL Controle positivo da amostra: endotoxina + amostra + LAL – verificar a interferência da amostra com a sensibilidade do lisado – 0,5 a 2 λ Padrão: diluições endotoxina + LAL - 0,5 a 2 λ Amostra: diluições produto + LAL → UE/ml

Teste de Endotoxinas bacterianas Cálculos e interpretação Sensibilidade do lisado - antilogaritmo da média dos 2 pontos finais convertidos em log Concentração de endotoxina na amostra: sensibilidade rotulada do lisado multiplicado pela diluição da amostra na última reação positiva A concentração de endotoxina na amostra deve ser inferior à especificada na monografia individual

Teste de Endotoxinas bacterianas Exemplo: Sensibilidade rotulada do lisado (λ) = 0,12 UE/ml Controle negativo: água + LAL Controle positivo da amostra: 10-0,921 = 0,12 UE/ml (0,06 – 0,24) Réplicas 0,50 0,25 0,12 0,06 0,03 Ponto final Log10 do ponto final 1 +  -0,921 2  média = -0,921

Teste de Endotoxinas bacterianas Exemplo: Sensibilidade rotulada do lisado (λ) = 0,12 UE/ml Controle positivo – padrão 10-1,072 = 0,08 UE/ml (0,06 – 0,24) Réplicas 0,50 0,25 0,12 0,06 0,03 Ponto final Log10 do ponto final 1 +  -0,921 2 -1,222  média = -1,072

Teste de Endotoxinas bacterianas Exemplo: Sensibilidade rotulada do lisado (λ)= 0,12 UE/ml Amostra: 10-1,054 = 0,088 // 1/0,088 = 11,4 Réplicas 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Ponto final Log10 do ponto final 1 +  1/8 = 0,125 -0,903 2 1/16 = 0,0625 -1,204  média = -1,054

Teste de Endotoxinas bacterianas Cálculo da concentração de endotoxina Multiplica-se a concentração de endotoxina pela sensibilidade do lisado rotulada (λ) 0,12 x 11,4 = 1,37 UE/ml Esse valor deve ser inferior ao especificado na monografia individual

Teste de Endotoxinas bacterianas Máxima diluição válida (MDV) A amostra não pode ser diluída indefinidamente. Prejuízo da detecção de endotoxina Se o limite é expresso em UE/mg ou UE/UI, utilizar a fórmula acima Se o limite é expresso em UE/ml, basta dividi-lo por λ

Teste de Endotoxinas bacterianas Máxima diluição válida (MDV) O resultado da diluição da amostra não deve ser maior que a MDV → mais diluído que a MDV Pode se utilizar reagente LAL de sensibilidade maior, permitindo soluções amostra mais diluídas

Teste de Endotoxinas bacterianas Fatores críticos para o teste utilizando LAL: Tempo: 60 ± 2 minutos. Temperatura: 37 ± 1 oC (banho-maria ou estufa) Não expor os tubos a vibrações – resultados falso-negativos pH: 6,0 a 7,5. Perda de sensibilidade do lisado Perda de água por evaporação - concentração

Teste de Endotoxinas bacterianas Fatores críticos para o teste utilizando LAL: Concentração adequada de cátions divalentes – já adicionados no reagente LAL