DESENVOLVIMENTO DE ESTRATÉGIAS FARMACOTÉCNICAS PARA A MELHORIA DAS CARACTERÍSTICAS BIOFARMACÊUTICAS DO MESILATO DE SAQUINAVIR E AVALIAÇÃO PRÉ-CLÍNICA DA SUA ABSORÇÃO INTESTINAL Execução: Thiago Caon (Doutorando PPG Farmácia) Coordenadora: Cláudia Maria Oliveira Simões Depto. Ciências Farmacêuticas, CCS, UFSC

Recursos Humanos envolvidos II. Profa. Letícia Koester – desenvolvimento das formulações Profa. Silvia Cuffini e Prof. Carlos Eduardo Maduro Campos – caracterização físico-química UFRGS UFSC Doutorando Thiago Caon, Ricardo Konig (IC) e Profa. Cláudia M.O. Simões Profa. Simone Cardoso (Lab. de Controle de Qualidade) – testes de estabilidade acelerada Dr. Jadel Kratz e Prof. Gustavo Micke – estudos de permeabilidade intestinal in vitro e de biodisponibilidade in vivo III. IV. UFSC UFSC

Introdução UNAIDS (2011) – 34 milhões de infectados com HIV no mundo Cerca de 70% dos casos na África Sub-Sahariana Ao final de 2010, aproximadamente 34 milhões de indivíduos estão infectados com HIV... Maior parte dos casos dos indivíduos infectados encontra-se na Ásia Sub-Sahariana>> UNAIDS = Joint United Nations Programme on HIV/AIDS BRASIL (1980-2008) – 506 mil casos, com aproximadamente 205 mil óbitos, sendo a Região Sudeste a mais afetada (BRASIL, 2008)

Introdução Desde 1986 – atuação do Ministério da Saúde com a distribuição gratuita de medicamentos Principal reflexo – redução das taxas de hospitalização (economia estimada em US$ 2 bilhões até 2006) e das taxas de incidência no país – de 22,2 casos/100 mil hab. em 2002 para 17,5 casos/100 mil hab. em 2006 (OKIE, 2006; BRASIL, 2007) 1997-2007 – aumento do número de pacientes em 5X (GRECO; SIMÃO, 2007) Alternativas – sendo uma delas as chamadas públicas – MCT/CNPq – Ministério da Saúde/DECIT – Secretaria Estadual de Saúde e FAPESC Comprometimento desta política Alternativas para contornar este problema

Introdução ALTERNATIVAS - Análise custo-efetividade de medicamentos a serem incluídos nas terapias combinadas (curto prazo); - Dispensação racional destes medicamentos; - Diagnóstico precoce e a prevenção da patologia, para evitar a disseminação do HIV; - Estudos farmacotécnicos para fins de melhoria dos aspectos biofarmacêuticos de formulações contendo fármacos antirretrovirais, tal como o aumento da sua biodisponibilidade;

Resistência viral aos medicamentos disponíveis Introdução Resistência viral aos medicamentos disponíveis Necessitam de novos fármacos e novos esquemas antirretrovirais, denominados “esquemas de resgate” Mesilato de saquinavir – inibidor de protease (mimetizam ligação peptídica - clivada pela protease do HIV)

Baixa biodisponibilidade (cerca de 3-4%) BDP aumentou em cerca de 3X Introdução POR QUE SAQUINAVIR??????? - Fármaco constante da Relação Nacional de Medicamentos (2010); - Integra o esquema terapêutico do Programa Nacional DST/AIDS (MS); - Inconveniências relacionadas à sua biodisponibilidade e absorção intestinal. Invirase® (Roche) Fortovase® (Roche) 5 cps = 2x/dia 2 cps = 2x/dia 500 mg 200 mg INVIRASE com reforço de RITONAVIR (100mg = 1 cápsula a cada 5 cps de saquinavir) Baixa biodisponibilidade (cerca de 3-4%) BDP aumentou em cerca de 3X 5cps = 2x/dia (1 cps =200 mg)

Introdução (ROCHE, 2005)

(cooperação Lab. Cristália e Farmaguinhos) JUSTIFICATIVA PARA NOVAS PESQUISAS ENVOLVENDO ESTRATÉGIAS FARMACOTÉCNICAS - Gastos públicos nacionais em torno de R$ 1 bilhão/ano – desenvolvimento de estratégias para redução do custo de produção; - Redução do tamanho das cápsulas – aumentar a adesão dos pacientes; - Aumento da biodisponibilidade. 1a tentativa – Svir® (cooperação Lab. Cristália e Farmaguinhos) SVIR - CÁPSULA SAQUINAVIR MESILATO, DOSAGEM 200 MG, APRESENTAÇÃO CÁPSULA GELATINOSA MOLE  Ver biodisponibilidade do Svir (equivalente ao produto de referências, porém, quando foram preparadas minicápsulas observou-se dos parâmetros farmacocinéticos).

Proposta deste trabalho DESENVOLVIMENTO DE SISTEMAS AUTO-EMULSIONÁVEIS DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS Aumento da biodisponibilidade para fármacos fracamente solúveis em água através da preparação de dispersões sólidas

Introdução Fármacos com baixa solubilidade aquosa (SERAJUDDIN, 1999) Comprimidos/cápsulas FF Dispersão sólida/solução Desintegração Desintegração Partículas sólidas grandes (5-100 mícron) Fármaco no TGI Partículas coloidais (menor que 1 mícron) Baixas taxas de dissolução Altas taxas de dissolução Absorção sistêmica

DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE TRIGLICERÍDEOS Introdução DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE TRIGLICERÍDEOS Lúmen intestinal Formulação (emulsão ou base semi-sólida) contendo triglicerídeos Sais biliares/ lecitina Rápido Rápido Solução micelar Lipase pancreática Degradação do veículo

Introdução Fármaco Carreador Carreador+fármaco

Objetivo Desenvolver sistemas autoemulsionáveis semi-sólidos para uma melhoria da solubilidade e biodisponibilidade do mesilato de saquinavir (MS).

SELEÇÃO DOS ADJUVANTES DAS FORMULAÇÕES Metodologia SELEÇÃO DOS ADJUVANTES DAS FORMULAÇÕES Consulta na literatura, custo e ensaios de pré-formulação (solubilidade, pH, microscopia óptica) Solubilidade – formação ou não de precipitado pH – preferencialmente ácido (maior solubilidade do fármaco em pHs baixos) Microscopia óptica – distribuição uniforme do fármaco na base

Resultados e Discussão PVP K30 Polietilenoglicol GELUCIRE 44/14 Composição: 20% de mono-, di- e triglicerídeos; 72% de mono- e diésteres de ácido graxo de PEG e 8% de PEG 1500. FALAR DAS FUNÇÕES DE CADA ADJUVANTE Ácido cítrico e ácido cólico não foram considerados na formulação - formação de precipitado amarelo – processo de oxidação (?) PQ UTILIZAR GELUCIRE??? Aumenta a taxa de dissolução de fármacos pouco solúveis, o que garante um incremento de biodisponibilidade (Damian et al., 2000; Gupta et al., 2001) Utilização em matrizes de liberação prolongada (Mouricot et al., 1990). Pode atuar como inibidor da glicoproteína P (envolvida nos mecanismos de efluxo) Polissorbato 80 (Tween 80)

2. PREPARO DAS FORMULAÇÕES

Metodologia FUSÃO DA BASE/CARREADOR ENVASE/SOLIDIFICAÇÃO Solidificação Aquecimento (20oC acima do PF da base) Pesagem de todos os componentes da formulação Agitação (3 ciclos de 1 min cada, intervalos de 1 min) Temp. ambiente -20oC 18

Resultados e Discussão Gelucire 44/14 PEG 4000 +PVP K30 +Tween80 +PVP K30 +Tween80 O artigo utilizado como referência p/ método de CLAE utilizou uma proporção de solventes de 50:50. 6 formulações para teste 2 temperaturas e 2 tempos 19

3. DOSEAMENTO DO MESILATO DE SAQUINAVIR

Metodologia/Resultados e Discussão Método de CLAE selecionado Fase estacionária: C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm d.i.); Fase móvel: ACN: diidrogenofosfato de potássio pH=3 (60:40) Fluxo: 1 mL/min Detecção: 240 nm (UV) Alterações na fase móvel; Avaliação da seletividade; Reprodutibilidade; Linearidade O artigo utilizado como referência p/ método de CLAE utilizou uma proporção de solventes de 50:50. 21

4. ENSAIOS DE SOLUBILIDADE DISSOLUÇÃO

Esvaziamento gástrico Metodologia ENSAIOS DE DISSOLUÇÃO Esvaziamento gástrico Trânsito Absorção Dissolução Metabolismo Dissolução pelo método de pás da USP Meio gástrico – HCl 0,1 M 23

Resultados e Discussão 24

Resultados e Discussão å · - + = } 100 ] ) T R ( n 1 {[ log 50 2 f 5 . t 25

Resultados e Discussão

5. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS FORMULAÇÕES

Espectroscopia na região do infravermelho e RAMAN; Metodologia Difração de raios X; Espectroscopia na região do infravermelho e RAMAN; Análises microscópicas (óptica e de varredura). Significado de RAMAN 28

Resultados e Discussão A.TEMPERATURA AMBIENTE Gelucire B.CONGELADO Gelucire/Saquinavir/Tween80 Gelucire/Saquinavir/Tween80 2500 2500 Intensity Angle/(2θ) 10 20 30 40 50 60 Gelucire/Saquinavir/PVP K30 Gelucire/Saquinavir/PVP K30 Intensity Gelucire/Saquinavir Gelucire/Saquinavir 10 20 30 40 50 60 Angle/(2θ) Fig 1. X-ray patterns of saquinavir mesylate solid dispersion in presence of Gelucire 44/14 after preparation (black line) and storage for 1 week (gray line) at 25oC (A) or -20oC (B) Carreador não apresentou grandes variações na sua cristalinidade após 7 dias de armazenagem. Em geral, o fármaco mostrou-se mais cristalino após 7 dias de armazenagem nas três variações de formulação. 29

Resultados e Discussão Observou-se redução da cristalinidade da base (PEG4000) com o tempo de armazenagem. B.CONGELADO A.TEMPERATURA AMBIENTE PEG/Saquinavir/TW PEG/Saquinavir/TW 2500 Intensity Angle/(2θ) 10 20 30 40 50 60 PEG/Saquinavir 2500 Intensity Angle/(2θ) 10 20 30 40 50 60 PEG/Saquinavir PEG/Saquinavir/PVP K30 PEG/Saquinavir/PVP K30 Fig 1. X-ray patterns of saquinavir mesylate solid dispersion in presence of PEG 4000 after preparation (black line) and storage for 1 week (gray line) at 25oC (A) or -20oC (B) 30

Formulações com Gelucire 44/14 Formulações com PEG 4000 25oC -20oC i. Tween 80 / ii. Gelucire 44/14 / iii. PEG 4000 / iv. PVP K30 / v. Saquinavir mesylate

Resultados e Discussão Gelucire 44/14 Gelucire 44/14+Tween80 Gelucire 44/14+PVP K30 C E A PEG 4000 PEG 4000+Tween80 PEG 4000+PVP K30 MEV (apenas há diferenças quando se comparam formulações de diferentes composições). Não foi possível observar diferenças quanto as variações (temp. ambiente e congelado). Formação de poros na formulação contendo PEG e PVP>>>> (isto poderia explicar maior dissolução – maior acesso de água a formulação). B D F C 32

foram selecionadas para os experimentos subseqüentes. Com base nos resultados da caracterização físico-química, as formulações preparadas com PEG4000+PVP K30+SAQUINAVIR foram selecionadas para os experimentos subseqüentes.

6. Estudos de estabilidade acelerada Metodologia 6. Estudos de estabilidade acelerada ICH (1999) 3 meses Condição 1 Condição 2 Temperatura 40±2oC 25±2oC Umidade relativa 75±5% 95±5% Processo para controle de umidade Solução saturada de NaCl Solução saturada de K2SO4

Resultados & Discussão 25oC/95% RH 45oC/75% RH Dissolução DRX

7. Permeabilidade intestinal in vitro (modelo Caco-2) Em fase de finalização 7. Permeabilidade intestinal in vitro (modelo Caco-2) 1 Avaliação da citotoxicidade pelo ensaio colorimétrico do MTT (p/ definir as concentrações a serem usadas no modelo Caco-2); Inserto Transwell com membrana semi-permeável A – B e B – A 3 Compartimento apical 2 Monitoramento da integridade celular - Aferição diária da TEER (valores superiores a 300 /cm2); - Lucifer Yellow (LY) Cavidade da placa de cultura celular pH = 6 e 7,2; t = 2h; 100 rpm Compartimento basolateral (condição sink) Quantificação por CLAE 4 5 Balanço de massa

Resultados preliminares AB  BA BA  AB Efluxo Mesilato de saquinavir 6,34x10-6 3,12x10-5 4.85 MS+Verapamil 1,35x10-5 1,75x10-5 1.32 MS+PEG4000+PVPK30 4,82x10-6 4,11x10-5 8.23 MS+Gelucire 44/14+PVPK30 1,26x10-5 2,97x10-5 2.35 Inserto Transwell Compartimento apical Monocamada de células Compartimento basolateral Membrana permeável Direções de transporte

Grupos OH do PEG interagem com grupamento amina das proteínas. Resultados preliminares PEG reduz interação do saquinavir com proteínas do plasma, aumentando o tempo de meia-vida do fármaco na circulação sanguínea. Grupos OH do PEG interagem com grupamento amina das proteínas.

Em fase de finalização 8. Biodisponibilidade in vivo em cães (formulação selecionada vs. Svir®) Desenho experimental randomizado cruzado Formulação desenvolvida 1 semana Invirase® 1 semana Svir® Via oral 1 cápsula (200 mg) + 40 mL de água Amostras de sangue (2 mL) estão sendo coletadas com seringa heparinizada, através de catéter inserido na veia da pata, antes (tempo 0) e aos 15, 30, 45 min e 1, 2, 3, 4, 6, 8, e 24 após a administração das cápsulas. Quantificação por LC/MS. n = 6

Impactos do Projeto – Científico Domínio da técnica de preparo de dispersões sólidas, em escala piloto e dos fatores que interferem neste processo; Domínio de técnicas de caracterização físico-química; Acesso a diferentes metodologias analíticas (CLAE; LC/MS).

Impactos do Projeto – Econômico/Social Processo de produção é relativamente simples (não exige equipamentos sofisticados) e pouco custoso; Matérias-primas utilizadas estão disponíveis no mercado interno e a um custo acessível (firmar parcerias com fornecedores); Redução do custo por paciente; Redução no número de hospitalizações devido a maior eficácia terapêutica no caso de se evidenciarem melhorias na absorção intestinal; Novas oportunidades de parcerias institucionais.

Impactos do Projeto – Ambiental Sistema de produção das formulações não utiliza solventes tóxicos e não gera sólidos residuais (pode ocorrer variações em função de escalonamento de produção industrial);

Aplicabilidade para o SUS Embora já tenham sido observadas melhorias na liberação do fármaco a partir das formulações propostas, é necessário comprovar se isto resultará em maior absorção intestinal (etapa final do projeto, já em andamento); Caso os benefícios esperados sejam confirmados, há possibilidade de se desenvolver novos medicamentos (dispersões sólidas de mesilato de saquinavir) através de parceria com Cristália/Fiocruz. Reforço do papel do Brasil no cenário internacional no que diz respeito ao desenvolvimento de antirretrovirais. Redução do custo do tratamento/paciente.

Produção Científica CAON T, KOESTER LS, KÖNIG RA, CUFFINI SL, CARDOSO SG, SIMÕES CMO. Dissolution enhancement of saquinavir mesylate by different solid dispersions. In: International Congress of Pharmaceutical Sciences, Ribeirão Preto, 2011. KONIG RA, CAON T, CUFFINI SL, CARDOSO SG, CAMPOS CEM, KOESTER LS, SIMÕES CMO. Influência da temperatura e da umidade na estabilidade do Gelucire 44/14. In: XXI Seminário de Iniciação Científica, Florianópolis, 2011. CAON T, KOESTER LS, KÖNIG RA, CUFFINI SL, CARDOSO SG, CAMPOS CEM, SIMÕES CMO. Preparation and evaluation of mesylate saquinavir solid dispersion (submitted to the International Journal of Pharmaceutics).

Considerações Finais - Projeto em fase de finalização, cujas etapas foram realizadas com sucesso. - Conformidade com o cronograma proposto. - Execução orçamentária Parcela 1 – Custeio e capital: ok Parcela 2 – Custeio e capital: ok, em processo de prestação de contas - Formação de recursos qualificados na área. AS INFORMAÇÕES ABAIXO DEVEM SER MENCIONADAS EM OUTRO MOMENTO. Formulações preparadas com PEG4000 e PVP mantiveram o perfil de dissolução com o armazenamento, bem como suas características físico-químicas. Há fortes indícios de que estas formulações sejam estáveis e, caso apresentem absorção intestinal considerável, é possível utilizá-las clinicamente.

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