CENTRO UNIVERSITÁRIO FRANCISCANO MESTRADO ACADÊMICO EM NANOCIÊNCIAS DISCIPLINA: NANOTECNOLOGIA Seminário IV Ana Paula Tasquetto da Silva, Benonio Villalba e Iuri Jauris Profª Drª Marta Palma Alves Profª Drª Renata Raffin Profª Drª Solange Fagan

ARTIGO Fator de impacto: 7.365

INTRODUÇÃO Câncer de próstata potencialmente letal 6° tipo de câncer mais comum no mundo, e 3° mais comum em homens Tratamento  Quimioterapia Paclitaxel (PTX) - nome comercial Taxol®, Bristol-Myers Squibb.

Problema Solução Alta toxicidade, especialmente hematológica. INTRODUÇÃO Problema Alta toxicidade, especialmente hematológica. Diversos casos de interrupção do tratamento! Solução Nanopartículas magnéticas funcionalizadas e revestidas por “casca” ou polímero hidrofílico

Potencialidades Melhora o contraste em ressonância magnética; INTRODUÇÃO Potencialidades Melhora o contraste em ressonância magnética; Entrega vetorizada do fármaco; Maior capacidade de armazenamento de fármaco; Boa dispersão em solução aquosa; Biocompatibilidade com células e tecidos.

Como revestir as nanopartículas magnéticas com PTX? INTRODUÇÃO Como revestir as nanopartículas magnéticas com PTX? Polianilina (PAn)  biocompatível em aplicações in vivo e in vitro  aplicados na engenharia biomédica e em biosensores. Porém!  fracas propriedades hidrofílicas  limita sua aplicação biomédica. Solução: Modificar PAn estruturalmente  PAn + anidrido succínico  poly[aniline-cosodium N-(1-one-butyric acid) aniline] (SPAnNa)

INTRODUÇÃO

Preparação das SPAnH/MNPs METODOLOGIA Preparação das SPAnH/MNPs MNPs de Fe3O4 Co-precipitação FeCl3 e FeCl2 – 4H2O dissolvidos em 400 mL de água e agitados por 5 min. MNPs foram dispersas por sonicação e separadas da solução através de um ímã misturadas com SPAn e dopados com HCl 0,2 M. Formação de SPAnH/MNP espectroscopia no infravermelho.

Caracterização das SPAnH/MNPs METODOLOGIA Caracterização das SPAnH/MNPs Tamanho e morfologia microscopia eletrônica de transmissão. Tamanho hidrodinâmico espalhamento de luz dinâmico (Zetasizer). Magnetização MNPs dispositivo supercondutor de interferência quântica (SQUID). Concentração do grupo carboxila na superfície da amostra método TBO.

Ensaio de estabilidade e atividade do PTX conjugado METODOLOGIA Ensaio de estabilidade e atividade do PTX conjugado Atividade do PTX conjugado ensaio da proteína tubulina medida através do monitoramento do aumento da Abs (380 nm por 1h). Densidade óptica ELISA. Estabilidade PTX livre e conjugado variações de sua atividade utilizando o teste da proteína tubulina, após armazenamento a 25 e 37 ºC, por 21 dias.

Análise de Western blot METODOLOGIA Análise de Western blot Células CWR22R foram tratadas com PTX livre e conjugado. Proteínas foram quantificadas pela análise de Bradford. Lisados celulares membrana nitrocelulose bloqueadas com tampão TBS e imunocarregadas com anticorpos primários contra tubulina e β-actina. Incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase.

Ensaios de citotoxicidade in vitro METODOLOGIA Ensaios de citotoxicidade in vitro Células PC3 e CWR22R cultivadas em meio RPMI + soro fetal bovino + gentamicina + penicilina + estreptomicina. 50 µL de SPAnH/MNPs com PTX livre e PTX conjugado foram adicionados ao meio de cultura. Medição por densidade óptica 490 nm leitor de ELISA. Culturas celulares realizadas na presença de campo magnético de 800 Gauss.

Estudos de captação celular METODOLOGIA Estudos de captação celular Células PC3 e CWR22R foram incubadas com SPAnH/MNPs por 2h a 37 ºC. Fixadas por glutaraldeído 3%. Células colocadas em moldes coradas com acetato de uranila 4% e citrato de chumbo. Imagens TEM com uma tensão de aceleração de 100 kV e microscopia confocal.

Caracterização SPAnNa e SPAnH/MNPs RESULTADOS Caracterização SPAnNa e SPAnH/MNPs Espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios X (XPS) Picos centrados em 398,2 eV (-N=), 399,3 eV (-N-) H 399,8 eV (-N-) R

A espessura da “casca” foi de aproximadamente 1,5 nm. RESULTADOS Imagens de MET  MNPs e SPAnH/MNPs possuem 8 e 11 nm de diâmetro, respectivamente. A espessura da “casca” foi de aproximadamente 1,5 nm. O tamanho hidrodinâmico das MNPs e SPAnH/MNPs foi cerca de 80,6 e 73,7 nm, respectivamente.

RESULTADOS O potencial zeta do SPAnH/MNPs em água deionizada foi de 43,5 ± 1,07 mV e diminui para -30,5 ± 0,45 mV quando o PTX foi incorporado ao SPAnH/MNPs. SQUID  Tanto as MNPs como SPAnH/MNPs apresentam características de superparamagnetismo.

RESULTADOS Espectroscopia FT-IR: Picos não mudam quando comparados SPAnH e MNPs separadamente com o SPAnH/MNPs; Para COOH C=O pico em 1707 cm-1 O-H pico em 3410 cm-1 Fe-O pico em 582 cm-1

Atividade e estabilidade térmica PTX + SPAnH/MNPs RESULTADOS Atividade e estabilidade térmica PTX + SPAnH/MNPs Máximo de 302,75 μg de PTX pode ser associado a 1mg de SPAnH/MNPs Decréscimo na atividade relativa  fraca interação de alguns grupos funcionais do PTX com a tubulina

RESULTADOS A melhora sensível na estabilidade térmica do SPAnH/MNPs + PTX prolonga o tempo de duração no qual o PTX pode circular eficientemente no organismo.

RESULTADOS Captação celular Co-cultura de células PC3 com Cy5/SPAnH/MNPs por 8 h não tinha efeito sobre o equilíbrio dinâmico entre tubulina e microtúbulos. No entanto, os conjugados podem ser guiadas e concentrada para o fundo das placas de cultura através da aplicação de um campo magnético, resultando em conjugados mais ser interiorizados nas células. Alguns conjugados (cor vermelha) foram aprisionadas dentro dos lisossomos (cor verde) em um tempo de incubação e mostrado em amarelo imagem da fluorescência, o que implica que não houve aparente efeito citotóxico.

RESULTADOS Imagem confocal de células PC3 expostas a Cy5/SPAnH/MNPs conjugadas por 8 h (A) sem e (B) com a aplicação de campo magnético (800 Gauss).

RESULTADOS Imagens de MET (A) células PC3 (B) e células CWR22R (ambos 10.000) As nanopartículas em negro de células PC3 e CWR22R (fig. A, B) são Fe3O4. Assim, PTX ligado as SPAnH / MNPS é transportado para as células de forma rápida e eficaz, aumentando a eficácia do tratamento e diminuindo a dose.

RESULTADOS Western blot Tratamento de células CWR22R durante 24 h com diferentes concentrações de PTX livre e conjugado não teve nenhum efeito perceptível em β-actina. No entanto, o tratamento com 10 mM de PTX livre ou conjugado reduziu os níveis de α-tubulina para 52% e 63%, respectivamente, em relação aos controles não tratados. A redução observada com PTX-limite foi aprimorado para 81% quando um campo magnético foi aplicado durante a cultura fazendo aumentar significativamente a concentração do fármaco para a área específica.

RESULTADOS Isto sugere que, após o tratamento com PTX livre e conjugado, as tubulinas reuniriam rapidamente aos microtúbulos e isto resultou a não formação de mitose, consequentemente induzindo a apoptose. Análises de Western blot de α-tubulina e β-actina em células CWR22R tratados por 24 horas com (A) 0 mM (controle); (B) 2 mM, (C) 5 mM, e (D) 10 mM livre PTX; (E) 2 mm (F) 5 mM, (G) 10 mM PTX-ligado; células tratadas com (H) 2 mM, (I) 5 mM, e (J) 10 mM PTX conjugado foram submetidos ao campo magnético (800 Gauss).

Citotoxicidade in vitro RESULTADOS Citotoxicidade in vitro A citotoxicidade sem e com PTX conjugado as células PC3 e CWR22R foram obtidos através do método de ensaio XTT. A viabilidade celular após 48 h de incubação com SPAnH / MNPS em diferentes concentrações, demonstraram que as células PC3 e CWR22R co-cultivados com SPAnH / MNPS permaneceram viáveis em comparação com o controle quando a concentração de SPAnH / MNPS foi de até 500 µg/mL .

RESULTADOS No entanto, PTX livre e conjugado foram tóxicos para os dois tipos de células de modo dose-dependente. No caso da célula PC3, o IC50 (50% inibição do crescimento celular) de valor-limite PTX foi 9,7 µg/mL mais baixa do que a de PTX livre (11,1 µg/mL) e foi significativamente reduzida para apenas 4,6 µg/mL para a aplicação magnética direcionamento para o PTX-limite.

RESULTADOS Da mesma forma, no caso de células CWR22R, o valor de IC50 do PTX conjugado foi de 4,2 µg/mL mais baixa do que o PTX livre (7,1 µg/mL) e foi bastante reduzido para apenas 1,7 µg/mL para a aplicação magnética segmentação para o PTX-limite.

Microscopia de Fluorescência RESULTADOS Microscopia de Fluorescência SPAnH / MNPS sozinho não teve efeito citotóxico em células PC3 ou CWR22R (fig. a), mesmo quando um campo magnético foi aplicado (fig. e).

RESULTADOS No entanto, o número de células mortas (em vermelho) aumentou quando a dose de PTX-limite aumentou (fig. b,d).

RESULTADOS Além disso, quando PTX estava conjugado poderia ser concentrada uma área específica por um campo magnético aplicado (fig. f) (maioria das células mortas na região).

CONCLUSÃO Em resumo, uma molécula SPAnH/MNPS atóxica, transportadora de fármaco contendo carboxilas foi desenvolvida com sucesso e poderá ser utilizada de forma eficaz para imobilizar o fármaco hidrofóbico PTX. Além disso, estudos de estabilidade térmica mostraram um aumento na meia-vida do composto, para a temperatura de 37°C, de 19h do fármaco livre para 57h para o fármaco associado às nanopartículas.

CONCLUSÃO O PTX associado às nanopartículas pode ser concentrado no local do tumor por aplicação de campo magnéticos, reforçando a sua eficácia terapêutica. O fármaco associado às nanopartículas apresentou ainda uma melhora de 58,6% a 76,1% na inibição do crescimento das células cancerígenas. Eficácia do tratamento do tumor, ou seja, com menor dose terapêutica e potencialmente, menos efeitos colaterais.