Produção de Antibióticos

Introdução Homem e microrganismo partilham uma vida em comum “desde sempre” Somente século XIX demonstrou-se a origem infecciosa de vária enfermidades do homem (Pasteur, Koch e contemporâneos) 1ªs descrições sobre o uso de antimicrobianos datam de 3000 anos

Uso empírico Médicos chineses usavam bolores para tratar tumores inflamatórios e feridas infecciosas 1500: médicos indianos recomendavam a ingestão de certos mofos para a cura de desinterias índios norte-americanos: fungos para tratamento de feridas

Uso empírico Maias: usavam fungos para úlceras e infecções intestinais Hipócrates (400 aC) recomendava o uso de bolores tostados para tratamento das doenças genitais femininas

Noção de Ambiose/Antibiótico 1889 (Vuillemin): processo natural de seleção pelo qual um ser vivo destrói outro para assegurar sua própria sobrevivência 1899 (Ward): antagonismo microbiano 1944 (Waskman): antibiótico - substância química produzida por microrganismo capaz de inibir o crescimento ou destruir outro microrganismo

Primeiro Antibiótico Setembro de 1928: Alexander Fleming estudando culturas de Staphylococcus aureus - contaminação por fungo - ausência de crescimento ao redor do fungo Estudou o fenômeno: Fungo: Penicillium (Penicillium notatum) Elaborava uma substância - difundia no meio Efeito antimicrobiano

Primeiro Antibiótico II Continuidade do estudo: Substância era filtrável Não tóxica para animais exercia atividade bacteriana contra estáfilococos e outras bactérias (principalmente G+) Denominação: PENICILINA

Não valorização de imediato Descoberta: como curiosidade até 1939 Dubos isola tirotricina de culturas do Bacillus brevis (bactéria do solo) Atividade bacteriana potente Alta toxicidade para uso sistêmico (abandonado) Mas foi suficiente para estimular este ramo da ciência

Retomada da Penicilina Florey e Chain (Oxford 1940) retomam as pesquisas de Fleming Novas técnicas para obtenção logo surgiram (inicia-se o melhoramento) 12/02/1941: 1º uso em humano - policial de Londres com septicemia por estafilococos boa melhora até fim do estoque (17/02)... falecimento em 15/03

Mudança de continente 1941: grandes a dificuldades técnicas para obtenção do produto na Inglaterra 2ª guerra mundial piorava a situação Florey e equipe migram para os E.U.A suporte técnico e científico facilidades materiais e financeiras obtenção em escala industrial

Uso corrente 1943 uso corrente da penicilina Surge necessidade de quantidades cada vez maiores (principalmente pela guerra) Necessidade de novas e melhores técnicas novos tipos de Penicillium (maior rendimento) Penicillim chrysogenum - hoje grandes fábricas, fermentadores com mais capacidade melhorias nos métodos de fermentação

Evolução melhorias no refinamento melhorias no controle de qualidade Seleção de cepas: Fleming: 2 UI/mL, atualmente 85.000 UI/mL (0,0012 g/L p/ 50 g/L) Grande escala Maior grau de purificação Menores custos

Fermentadores atuais

Penicilina: Muito do que se aprendeu na transformação das observações laboratoriais de Fleming numa operação de larga escala, economicamente viável, pavimentou o caminho para a produção de outros agentes antimicrobianos, a medida que foram descobertos

Resultados incentivam novas descobertas Cientistas buscam novas substâncias Selman Waksman e equipe dedicavam-se a estudos de microrganismos do solo, particularmente os Actinomicetos 1940: Actinomicina A 1942: Estreptotricina tóxicas para uso mas alento para novas pesquisas

Outros compostos surgem: 1943: Estreptomicina (Streptomyces griseus) 1944: começa a ser usada Ativa contra: bacilos gram negativos Mycobacterium tuberculosis Penicilina+Estreptomicina - revolução

Pendências existiam: Não cobriam todas as infecções Alguns pacientes: reações alérgicas Necessidade de melhora da via para administração das medicações (VO) Provocam explosão cientifica concentração em microrganismos do solo fungos e bactérias (em particular: Actinomicetos – 70% dos antibióticos)

1961 - 513 antibióticos descobertos atualmente: cerca de 8000 antibióticos 1954 - 1.000 toneladas produzidas atualmente - estimada em + de 25mil ton - uso indiscriminado EUA - U$ 1 bilhões em antibióticos Usos atuais: indústria, agricultura, pecuária e ambientes domésticos

Penicilium griseofulvum Dierckx Penicillium janczewski Estreptomicina Nome Data da descoberta Microorganismo Penicilina 1929-40 Penicillium notatum Tirotricina 1939 Bacillus brevis Griseofulvina 1945 Penicilium griseofulvum Dierckx Penicillium janczewski Estreptomicina 1944 Streptomyces griseus Bacitracina Bacillus lincheniformis Cloranfenicol 1947 Streptomyces venezuelae Polimixina Bacillus polymyxa Clortetraciclina 1948 Streptomyces aureofaciens Cefalosporina C, N e P Cephalosporium sp Neomicina 1949 Streptomyces fradiae Oxitetraciclina 1950 Streptomyces rimosus Nistatina Streptomyces noursei Eritromicina 1952 Streptomyces erithreus Espiramicina 1954 Streptomyces ambofaciens Vancomicina 1956 Streptomyces orientalis Kanamicina 1957 Streptomyces kanamyceticus Ácido fusídico 1960 Fusidium coccineum Lincomicina 1962 Streptomyces lincolnensis Gentamicina 1963 Micromonospora purpurea Tobramicina 1968 Streptomyces tenebraeus

Importância de novos antibióticos Desenvolvimento lento e custoso. A partir de 1995 – um ou dois antibióticos por ano. Base primária – produtos naturais – triagem melhoramentos (sintéticos e semi-sintéticos) – modificações químicas. Novos patógenos, resistência e efeitos colateráis.

Produção de Antibióticos Diretamente ligada ao ciclo de vida, condições do meio e fatores de regulação. Fatores de regulação controlam o metabolismo secundário e a diferenciação celular. Ex. Fator A – S. griseus – estreptomicina (Horinouchi & Beppu, 1994) Cepa específica e não espécie.

GRUPOS MICROBIANOS PRODUTORES DE ANTIBIÓTICOS Os antibióticos são produzidos por bactérias, actinomicetos e fungos, sendo que na tabela abaixo temos a distribuição dentro dos grupos taxonômicos. Grupo taxonômico Número de antibióticos Bactérias diferentes de actinomicetos 950 Actinomicetos 4600 Fungos 1600

Via de Produção Do grande número de antibióticos conhecidos de origem microbiana, somente 123 são produzidos atualmente por fermentação. Além disso, mais de 50 antibióticos são produzidos como compostos semi-sintéticos e 3 (cloranfenicol, fosfomicina e pirrolnitrina) de forma completamente sintética.

Fermentação A produção destes compostos, como por exemplo a Penicilina, é realizada da seguinte forma: Preparação do inóculo; Preparação e esterilização do meio, Inoculação do meio no fermentador; Aeração forçada com ar estéril durante a incubação; Remoção do micélio após a fermentação; Extração e purificação da penicilina. Grande parte dos outros agentes antibióticos são produzidos da mesma forma, sendo que as principais diferenças estão relacionadas com o microrganismo empregado, a composição do meio e o método de extração (purificação).

As indústrias têm investido bastante na área de pesquisa, buscando processos produtivos cada vez mais otimizados, utilizando cepas melhores (modificadas geneticamente), adaptando as condições fermentativas para as mais apropriadas a cada espécie e empregando métodos de purificação mais eficientes que, diminuam ao máximo a carga de impurezas e assim os efeitos colaterais. Todavia, esta produção fermentativa, apesar de parecer simples e pouco onerosa, representa também problemas consideráveis não só em manter absolutamente estéreis fermentadores de grande volume (às vezes com mais de 100 m3), mas também por causa da instabilidade da capacidade produtiva do microorganismo.

Instabilidade Genética Afeta várias características como formação de micélio aéreo, esporulação, etc. Taxa de mutação de 0,1% a 25% por esporo – rearranjos: amplificações ou deleções no genoma. Deleções podem atingir até 2.000kb (Aikawa et al., 1999). Induzidos por brometo de etídeo, UV choque térmico ou espontaneidade

Melhoramento na produção Viabilizar economicamente a produção. Otimização do meio de crescimento, condições fermentativas, purificação, modificações genéticas semi-empíricas. Máxima produção antes do máximo crescimento limitação de substratos (estresse) Supressão da repressão catabólica, resistência ao próprio metabólito e eliminação do feedback regulatório.

Obtenção de cepas ideais Ao buscarmos cepas ideais para a produção de antibióticos, podemos lançar mão de inúmeras técnicas como mutações espontâneas ou induzidas, fusão de protoplasto (como o que já foi feito com a Cephalosporinum acremonium, cepa produtora de cefalosporina), cruzamentos via ciclo parasexual eTDR. A própria seleção natural já nos fornece cepas melhores, onde podemos citar como exemplo a descoberta da P. chrysogenum, a qual superou, em até 100 vezes a produção de penicilina, quando comparado à utilização da linhagem original descoberta por Fleming. Utilizando-se estas cepas “melhoradas” os custos dos antibióticos muitas vezes caem, além do que a produção é também aumentada.

Mutagênese clássica Agentes químicos ou físicos – UV, MNNG, MMS, NQO, EMS. Devido à instabilidade genética é necessário uma combinação de técnicas. Constante seleção de linhagens para manter alto nível de produtividade.

S – seleção; X – tratamento com raio X; UV I e II – radiação ultra-violeta; N – gás mostarda nitrogenada. Colchetes indicam o rendimento obtido em unidades Internacionais (UI) por mL

Recombinação genética Muito usados no início. Atualmente usado em cepas com dificuldades para mutagênese por outra via. Permite a combinação de marcas genéticas entre cepas, mas não existe um controle direto sobre o processo. Algumas marcas podem elevar muito o custo da produção

Transposons Elementos genéticos móveis com capacidade para se deslocar para novos sítios no genoma do hospedeiro. Causam mutações do tipo null, rearranjos no cromossomo e alterações na expressão gênica em genes reguladores e operons. Transposons são elementos muito úteis para estudos do genôma por técnicas moleculares.

Métodos Moleculares Barreiras de Restrição: produção de endonucleases que dificultam a formação de protoplastos e transformação. Dificuldade de infecção por actinofagos. Plasmídeos auto-replicativos: embora tenha grande utilidade, evidencias mostram que podem reduzir a produção de antibióticos.

Integração do DNA no cromossomo: forma de superar o problema com os plasmídeos auto-replicativos, utilizando vetores de clonagem ou transposons. Aumento do número de cópias do gene: alguns problemas como barreiras de restrição ou inibição por certos vetores. Genes regulatórios positivos e negativos: clonagem e inserção de genes regulatórios positivos ou disrupção de genes regulatórios negativos.

Novas Abordagens Para Obtenção de Antibióticos Antibióticos híbridos: demonstrada em 1985, mas somente em meados da década de 90 estabelecida para várias linhagens produtoras de antibióticos. Outras técnicas foram desenvolvidas neste período, como: biossíntese do precursor, mutassíntese, fusão de protoplastos, cruzamento intra-específico e biotransformação.

Técnica baseada na clonagem de genes heterólogos da biossítese de antibióticos em uma cepa que produz um composto similar. Duas abordagens: a) Clonagem de genes que codificam enzimas utilizadas em reações estruturais de modificação como metiltransferases, hidroxilases, redutases e oxidases. b) Clonagem ou mistura de núcleos de enzimas biossíntéticas que produzirá novos núcleos moleculáres.

Destaque para produção de novas drogas com atividade antitumoral, necessária devido principalmente pelo desenvolvimento de resistência múltipla a drogas quimioterápicas de vários tipos de câncer (superexpressão de uma glicoproteína P de 170KDa que expele a droga do interior da célula tumoral por um mecanismo de bombeamento ATP dependente)

Biossíntese combinatória: utilização de vias biossíntéticas manipuladas, de tal forma que elas possam ser reconstruídas de forma combinatória para produzir bibliotecas de pequenas moléculas que possam ser usadas na procura de novas moléculas.

Pós-Produção Tratamento do resíduo gerado: Efluentes complexos, específicos e biologicamente ativos Medicamentos e Matérias-primas (síntese) O que é válido para um caso nem sempre vale para o outro! Medley: trata aproximadamente 20m3 /dia Clariant: incinera 2700 ton/ano